雄激素分泌組織構(gòu)建中的種子細胞優(yōu)化和移植后促性腺激素的調(diào)節(jié).pdf

1、研究背景：
　　 由于先天性疾病、環(huán)境污染、工作壓力日益加劇和人口老齡化等原因，雄激素缺乏性疾病的發(fā)病率具有逐年上升的趨勢。因創(chuàng)傷、腫瘤等造成的睪丸缺失也常見于臨床，針對這類疾病，目前尚無滿意的治療措施。組織工程技術(shù)的不斷進步實現(xiàn)了構(gòu)建雄激素分泌組織的可能，有希望為治療上述疾病提供理想的治療手段。
　　 組織工程技術(shù)構(gòu)建雄激素分泌組織彌補了傳統(tǒng)睪丸假體無法同時補充激素的缺憾，還可避免單純細胞移植吸收過快、激素分泌功能難于

2、持久的缺點，但也面臨著眾多技術(shù)問題的制約。其中種子細胞來源問題一直是組織工程化雄激素分泌組織研究的瓶頸。本課題組在前期研究中已經(jīng)證實，采用差速貼壁法能夠從不同種屬的雄性睪丸內(nèi)獲得高純度的Leydig細胞，初步地解決了工程化雄激素分泌組織研究種子細胞來源缺乏的問題。但新方法尚缺少與傳統(tǒng)方法在得率、純度和睪酮分泌能力上的定量比較，而最佳的貼壁培養(yǎng)時間也缺少得率和純度上的驗證。其次Leydig細胞的功能調(diào)控尚需要睪丸支持細胞，在構(gòu)建中使用睪丸

3、整體消化所得細胞作為種子細胞也被證實可獲得比單純使用間質(zhì)細胞更好的結(jié)果。目前兩者的比例對于細胞移植治療和雄激素分泌組織的構(gòu)建效果具有何種影響尚不得而知。此外，差速貼壁法中間質(zhì)細胞的分離后所殘留的結(jié)構(gòu)完整的曲細精管，為進一步分離純化Sertoli細胞提供了可能。除種子細胞問題外，前期研究中采用組織工程方法構(gòu)建出的雄激素分泌組織移植后雖能在18周內(nèi)維持較高水平的睪酮分泌能力，并在組織學上觀察到在移植物中的血管化，但未能證實其分泌能夠接受機體

4、下丘腦-垂體的調(diào)控，從而真正按照生理節(jié)律分泌睪酮，因此仍需要進一步進行實驗驗證。
　　 研究目的：
　　 本研究擬通過比較差速貼壁法和傳統(tǒng)Percoll梯度密度離心法所獲得的兩組大鼠Leydig細胞在得率和純度上的差別，驗證新方法的可行性，并明確差速貼壁法中不同貼壁時間對細胞得率和純度的影響;進一步從差速貼壁法消化殘留的曲細精管中分離純化出Sertoli細胞，并驗證其得率和純度，與LC按照不同比例共同培養(yǎng)后檢測在睪酮分泌

5、能力上的差異;通過體外構(gòu)建及去勢動物回植實驗，檢驗分次消化的Leydig細胞和Sertoli細胞共同作為雄激素分泌組織種子細胞的可行性，以及下丘腦-垂體-性腺軸對其分泌能力有無調(diào)節(jié)作用，為雄激素分泌組織構(gòu)建研究提供種子細胞的優(yōu)化方案和移植后的功能評估。
　　 研究方法
　　 一.差速貼壁法和梯度密度離心法分離純化大鼠LC:消化所得細胞懸液分為5組，分別接受1、2、3、12小時的貼壁培養(yǎng)和進行梯度密度離心，所的細胞在分離即

6、刻和培養(yǎng)72后分別進行3β-HSD流式細胞學檢測，同時行細胞組織形態(tài)學鑒定和分泌功能的檢測。
　　 二.分離純化大鼠SC:在差速貼壁法分離出LC之后，對殘留的曲細精管使用分次消化法進一步分離純化出SC，檢測得率和純度，并行細胞組織形態(tài)學鑒定其特性，培養(yǎng)72小時后，與LC按照1∶1、1∶4、1∶9、0∶1四種濃度混合培養(yǎng)，檢測睪酮分泌情況。
　　 三.分步消化的LC和SC作為種子細胞構(gòu)建雄激素分泌組織:按上述方法分離純化的

7、LC和SC按照原始比例混合后接種于生物材料支架上，體外培養(yǎng)24小時候回植于大鼠腹腔，定期檢測血清睪酮和LH，與去勢鼠進行對比。
　　 四.對受移植大鼠進行LHRH激動劑的干預(yù):LHRH激動劑注射受移植大鼠、正常大鼠、去勢大鼠皮下，并以生理鹽水注射另一組受移植大鼠，分別檢測在短期和長期兩種干預(yù)方式下，各組大鼠在血清睪酮和LH水平上的差異，并晝夜節(jié)律對受移植大鼠進行飼養(yǎng)和采血，分析血清睪酮和LH的晝夜差異。
　　 研究結(jié)果：

8、
　　 第一部分差速貼壁法和梯度密度離心法的比較
　　 2小時是差速貼壁法分離Leydig系細胞的最佳時機，在細胞得率[(2.04±0.26)×106個/每克睪丸]、純度[（75.2土3.1）％]和睪酮分泌能力上均優(yōu)于密度梯度離心法(P＜0.05)，該方法對Leydig干細胞有較好的保留，并且操作簡便高效，具有可重復(fù)性，適用于Leydig細胞移植治療和組織工程化雄激素分泌組織的構(gòu)建。
　　 第二部分Leydig細

9、胞和Sertoli細胞的分步消化和體外培養(yǎng)比例
　　 睪丸組織經(jīng)差速貼壁法消化后殘留的曲細精管再經(jīng)胰酶和膠原酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶混合溶液連續(xù)消化后，SC得率(3.5±0.62)×106/每克睪丸，細胞存活率達95％以上。兩種細胞混合培養(yǎng)時的，LC和SC按照9∶1比例混合培養(yǎng)組的睪酮的下降速度要慢于單純的間質(zhì)細胞。
　　 第三部分促性腺激素對混合細胞構(gòu)建的雄激素分泌組織的調(diào)節(jié)
　　 分步消化得到的LC和S

10、C與支架材料都能良好地復(fù)合，所構(gòu)建的組織工程化雄激素分泌組織在3個月的觀察期內(nèi)能夠保持一定的體積和較穩(wěn)定的分泌功能，LHRH激動劑證實了組織工程技術(shù)構(gòu)建的雄激素分泌組織在體內(nèi)可接受下丘腦-垂體的上調(diào)增加分泌，所分泌的睪酮也可以對其產(chǎn)生負反饋。
　　 研究結(jié)論：
　　 本研究證實差速貼壁法能夠有效獲得大鼠睪丸Leydig系細胞的各級細胞成分，比percoll梯度密度離心法更便捷高效，LC的得率、純度和分泌功能均優(yōu)于后者;通