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文檔簡介
1、一、研究背景 由于先天性疾病、環(huán)境污染、工作壓力日益加劇和人口老齡化等原因,雄激素缺乏性疾病的發(fā)病率具有逐年上升的趨[1],遺憾的是,針對這類疾病,臨床尚無理想的治療措施。睪丸是男性的重要象征,對維持男性正常生理狀態(tài)、心理狀態(tài)都至關(guān)重要,這主要源于睪丸的兩大功能:一是生殖功能,即產(chǎn)生精子;二是維持男性第二性征,主要通過睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells,LC)合成并分泌雄激素來實(shí)現(xiàn)。因此,睪丸缺失和或雄激素缺乏,都將帶給男性
2、巨大的創(chuàng)傷。另外,睪丸外觀或功能異常對男性心理也會造成很大影響。因此,針對睪丸缺失和/或功能障礙,必須從外觀和功能兩方面治療。 組織工程技術(shù)的發(fā)展為重建能夠接受體內(nèi)生理性調(diào)節(jié)的雄激素分泌組織提供了可能LC分離純化技術(shù)的成熟,為細(xì)胞移植治療雄激素缺乏癥帶來了希望[2-4]。大量研究表明,LC移植后,在一定時期內(nèi)可以在受體內(nèi)產(chǎn)生雄激素,發(fā)揮補(bǔ)充替代作用,甚至某些研究已將其用于男性性功能低下患者的治療[5-8]。但這些方法在應(yīng)用中也遇
3、到很多問題:(1)雄激素分泌功能維持時間短暫。這可能與細(xì)胞移植后缺乏適宜的生長載體和生長環(huán)境有關(guān)[9-10];(2)不能重建睪丸外觀。單純細(xì)胞移植無法形成具有一定體積和形態(tài)的睪丸組織。這些問題的存在,嚴(yán)重限制了細(xì)胞移植技術(shù)的推廣應(yīng)用,探索更符合生物學(xué)原則的治療方法將是解決這些問題的關(guān)鍵。組織工程技術(shù)為解決這一難題提供了新策略,其基本原理是將少量種子細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后與生物載體結(jié)合,在體內(nèi)或體外構(gòu)建具有一定形態(tài)和生理功能的組織甚至器官。因此
4、,應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建具有一定形態(tài)和功能的睪丸組織,將是研究和治療這類特殊疾病的新途徑。本課題指導(dǎo)小組在前期已成功聯(lián)合應(yīng)用復(fù)合膠原酶及差速貼壁法分離出LC并研究其培養(yǎng)體系、睪丸內(nèi)貼壁體細(xì)胞共培養(yǎng)體系并得出結(jié)論睪丸微環(huán)境對LC具有營養(yǎng)支持作用、睪丸內(nèi)貼壁體細(xì)胞同基因鼠體內(nèi)移植可構(gòu)建出雄激素分泌組織[11];本課題將在其基礎(chǔ)上構(gòu)建具有睪丸外形的雄激素分泌組織,為雄激素缺乏、睪丸缺失性疾病提供一個更符合生理、更理想的治療方法。 二、研
5、究目的 1、對種子細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的可行性。 2、具有分泌功能的睪丸形態(tài)雄激素分泌組織在同基因動物體內(nèi)構(gòu)建的可行性。 三、研究內(nèi)容和方法 1、取80±20克(3周齡)雄性Wister大鼠雙側(cè)睪丸,聯(lián)合應(yīng)用復(fù)合膠原酶消化及差速貼壁法,分離培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞。 2、用Q-dot對部分睪丸體細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。。 3、取80±20克(3周齡)雄性Wister大鼠,經(jīng)陰囊去勢制備去勢鼠(等待飼養(yǎng)4周后回植)。
6、 4、取Wister大鼠功能良好的睪丸體細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組與有或無Medpor內(nèi)核的PLA+PGA生物支架分別復(fù)合,形成“細(xì)胞-生物材料”復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)分組:Medpor-PGA+PLA復(fù)合支架組(n≥6):2×107睪丸體細(xì)胞:PGA+PLA對照組(n≥6):2x107睪丸體細(xì)胞;空白組(n≥6):無細(xì)胞組;假手術(shù)組(n≥6:無細(xì)胞無材料組)。按分組將復(fù)合物、空載分別回植于已去勢4周的Wister大鼠陰囊內(nèi),回植后3月、6月取材,測定
7、血清睪酮水平及移植物行大體觀察及HE組織學(xué)染色。 四、研究結(jié)果 1、體外培養(yǎng)觀察: 量子點(diǎn)易于標(biāo)記睪丸體細(xì)胞,不排出胞外,熒光發(fā)光度強(qiáng)容易觀察,體外培養(yǎng)十余天、傳代后熒光仍未觀察到衰減,證明量子點(diǎn)標(biāo)記睪丸體細(xì)胞可行。 2、體外培養(yǎng)取材后觀察: 最長在體內(nèi)培養(yǎng)21周后仍能觀察到組織塊中的量子點(diǎn)紅光標(biāo)記,測血睪酮仍有激素分泌,說明標(biāo)記物可較長期標(biāo)記,不會輕易丟失在體內(nèi)培養(yǎng)后標(biāo)記物也可以較長期存在,不影
8、響組織塊形成、激素分泌,但紅光強(qiáng)度減弱。 3、睪丸體細(xì)胞復(fù)合睪丸形態(tài)的medpor-可降解生物材料形成的復(fù)合物回植入體內(nèi)后可形成組織塊,組織塊具有睪丸形態(tài),并具有分泌雄激素的功能。 4、睪丸體細(xì)胞復(fù)合可降解生物材料的復(fù)合物回植入體內(nèi)后維持較高水平的雄激素分泌功能,可達(dá)六月之久認(rèn)不衰減,再次印證了用本課題組前期發(fā)現(xiàn)的方法分離的睪丸體細(xì)胞是構(gòu)建雄激素分泌組織的優(yōu)良種子細(xì)胞來源。 5、睪丸形態(tài)的復(fù)合物回植體內(nèi)在3月時我
9、們選用的材料內(nèi)核與PGA/PLA層比例是合適的,它既能維持睪丸形態(tài),又能保證較高水平的雄激素分泌。而在更長時期的體內(nèi)培養(yǎng)中材料內(nèi)核與PGA/PLA層比例還有待于進(jìn)一步摸索,總之睪丸體細(xì)胞與睪丸形態(tài)的生物材料支架復(fù)合回植體內(nèi)維持形態(tài)保持激素較高水平分泌是可行的。 五、研究結(jié)論 量子點(diǎn)作為標(biāo)記物標(biāo)記睪丸體細(xì)胞可行,可作為構(gòu)建具有雄激素分泌功能的組織工程睪丸的種子細(xì)胞的標(biāo)記物。以醫(yī)用多孔高密度聚乙烯(Medpor)為內(nèi)支撐外裹
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