2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  1.構(gòu)建肝X受體(LXRs)過表達(dá)的慢病毒載體,進(jìn)一步感染H9C2細(xì)胞。
  2.觀察過表達(dá)LXRs對高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。
  3.探討過表達(dá)LXRs抑制H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制。
  方法:
  1.體外低糖正常培養(yǎng)H9C2細(xì)胞,再分別運(yùn)用高糖和慢病毒進(jìn)行干預(yù)。
  2.運(yùn)用酶切法從含目的基因的質(zhì)粒中獲取Nr1h2和Nr1h3對應(yīng)的基因片段,克隆到含綠色熒光蛋白GFP

2、基因的GV287慢病毒載體中,產(chǎn)生重組慢病毒質(zhì)粒:GV287-Nr1h2和GV287-Nr1h3。測序鑒定后與pHelper1.0、pHelper2.0共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,最后獲得攜帶Nr1h2和Nr1h3基因的重組慢病毒。
  3.將構(gòu)建的慢病毒感染H9C2細(xì)胞,感染后1-4天連續(xù)用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況,確定合適的感染復(fù)數(shù)(MOI)。
  4.實(shí)驗(yàn)分為五組:①Control組:正常對照組,用低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)

3、胞;②High glucose組:陽性對照組,用含33mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)胞;③LXRα組:感染GV287-Nr1h3慢病毒組;④LXRβ組:感染GV287-Nr1h2慢病毒組;⑤GFP組:感染空載體慢病毒組。
  5.慢病毒感染72h后,用CCK-8檢測各組H9C2細(xì)胞的增殖抑制率;同時應(yīng)用qRT-PCR法分別檢測LXRα、LXRβ和TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA的表達(dá);Western blot和

4、免疫熒光檢測NF-κB磷酸化蛋白的表達(dá)。
  結(jié)果:
  1.H9C2細(xì)胞從大鼠胚胎心臟組織的克隆細(xì)胞株亞克隆得到,在10%FBS低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)下分裂快,貼壁后呈梭形生長。
  2.成功構(gòu)建LXRs過表達(dá)的慢病毒載體,測序證實(shí)基因序列正確,包裝產(chǎn)生的病毒滴度為2×108TU/ml。
  3.LXRs過表達(dá)慢病毒感染H9C2細(xì)胞,當(dāng)MOI值為40時,24h后鏡下可見較弱的綠色熒光,72h后熒光表達(dá)最強(qiáng),加入終濃度為

5、8μg/ml的polybrene協(xié)同增加感染效率。
  4.qRT-PCR檢測LXRα和LXRβ mRNA表達(dá)結(jié)果:與Control組相比,LXRα組和LXRβ組mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01);而Control組與GFP組相比無明顯差異(P>0.05)。
  5.CCK-8檢測慢病毒對各組H9C2細(xì)胞的增殖:與Control組相比,Highglucose組抑制率最高(P<0.01);與High glucose組相比

6、,LXRα組和LXRβ組的抑制率均降低,LXRα組降低幅度更明顯(P<0.01);GFP組和High glucose組相比無明顯差異(P>0.05)。
  6.qRT-PCR檢測TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA表達(dá)結(jié)果:與Control組相比,High glucose組TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);LXRα和LXRβ組TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào),以

7、LXRα組幅度更顯著(P<0.01),GFP組和High glucose組相比無明顯差異(P>0.05)。
  7.免疫熒光檢測NF-κ B p65蛋白核轉(zhuǎn)位結(jié)果:Control組胞核紅色熒光表達(dá)極弱;而High glucose組和GFP組可見大部分胞核表達(dá)較強(qiáng)的紅色熒光,約占細(xì)胞總數(shù)的75%; LXRα組和LXRβ組分別約見40%和68%的胞核表達(dá)紅色熒光。
  8.Western blot檢測NF-κB磷酸化蛋白的表達(dá)結(jié)

8、果:與Control組相比,Highglucose組蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01);而LXRα和LXRβ組均能下調(diào)由高糖誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)水平,LXRα組下調(diào)幅度更顯著(P<0.01); GFP組和Highglucose組相比無明顯差異(P>0.05)。
  結(jié)論:
  (1)成功構(gòu)建了LXRs過表達(dá)的慢病毒載體,并高效感染H9C2細(xì)胞。
  (2)過表達(dá)LXRs能夠抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng),其中LXRα具有

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