慢病毒介導(dǎo)的LXRs過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.構(gòu)建肝X受體(LXRs)過(guò)表達(dá)的慢病毒載體，進(jìn)一步感染H9C2細(xì)胞。
　　2.觀(guān)察過(guò)表達(dá)LXRs對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。
　　3.探討過(guò)表達(dá)LXRs抑制H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外低糖正常培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，再分別運(yùn)用高糖和慢病毒進(jìn)行干預(yù)。
　　2.運(yùn)用酶切法從含目的基因的質(zhì)粒中獲取Nr1h2和Nr1h3對(duì)應(yīng)的基因片段，克隆到含綠色熒光蛋白GFP

2、基因的GV287慢病毒載體中，產(chǎn)生重組慢病毒質(zhì)粒:GV287-Nr1h2和GV287-Nr1h3。測(cè)序鑒定后與pHelper1.0、pHelper2.0共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，最后獲得攜帶Nr1h2和Nr1h3基因的重組慢病毒。
　　3.將構(gòu)建的慢病毒感染H9C2細(xì)胞，感染后1-4天連續(xù)用熒光顯微鏡觀(guān)察熒光表達(dá)情況，確定合適的感染復(fù)數(shù)(MOI)。
　　4.實(shí)驗(yàn)分為五組:①Control組:正常對(duì)照組，用低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)

3、胞;②High glucose組:陽(yáng)性對(duì)照組，用含33mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)胞;③LXRα組:感染GV287-Nr1h3慢病毒組;④LXRβ組:感染GV287-Nr1h2慢病毒組;⑤GFP組:感染空載體慢病毒組。
　　5.慢病毒感染72h后，用CCK-8檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞的增殖抑制率;同時(shí)應(yīng)用qRT-PCR法分別檢測(cè)LXRα、LXRβ和TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA的表達(dá);Western blot和

4、免疫熒光檢測(cè)NF-κB磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.H9C2細(xì)胞從大鼠胚胎心臟組織的克隆細(xì)胞株亞克隆得到，在10％FBS低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)下分裂快，貼壁后呈梭形生長(zhǎng)。
　　2.成功構(gòu)建LXRs過(guò)表達(dá)的慢病毒載體，測(cè)序證實(shí)基因序列正確，包裝產(chǎn)生的病毒滴度為2×108TU/ml。
　　3.LXRs過(guò)表達(dá)慢病毒感染H9C2細(xì)胞，當(dāng)MOI值為40時(shí)，24h后鏡下可見(jiàn)較弱的綠色熒光，72h后熒光表達(dá)最強(qiáng)，加入終濃度為

5、8μg/ml的polybrene協(xié)同增加感染效率。
　　4.qRT-PCR檢測(cè)LXRα和LXRβ mRNA表達(dá)結(jié)果:與Control組相比，LXRα組和LXRβ組mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.01);而Control組與GFP組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　5.CCK-8檢測(cè)慢病毒對(duì)各組H9C2細(xì)胞的增殖:與Control組相比，Highglucose組抑制率最高(P＜0.01);與High glucose組相比

6、，LXRα組和LXRβ組的抑制率均降低，LXRα組降低幅度更明顯(P＜0.01);GFP組和High glucose組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　6.qRT-PCR檢測(cè)TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA表達(dá)結(jié)果:與Control組相比，High glucose組TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01);LXRα和LXRβ組TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，以

7、LXRα組幅度更顯著(P＜0.01)，GFP組和High glucose組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　7.免疫熒光檢測(cè)NF-κ B p65蛋白核轉(zhuǎn)位結(jié)果:Control組胞核紅色熒光表達(dá)極弱;而High glucose組和GFP組可見(jiàn)大部分胞核表達(dá)較強(qiáng)的紅色熒光，約占細(xì)胞總數(shù)的75％; LXRα組和LXRβ組分別約見(jiàn)40％和68％的胞核表達(dá)紅色熒光。
　　8.Western blot檢測(cè)NF-κB磷酸化蛋白的表達(dá)結(jié)

8、果:與Control組相比，Highglucose組蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.01);而LXRα和LXRβ組均能下調(diào)由高糖誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)水平，LXRα組下調(diào)幅度更顯著(P＜0.01); GFP組和Highglucose組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)成功構(gòu)建了LXRs過(guò)表達(dá)的慢病毒載體，并高效感染H9C2細(xì)胞。
　　(2)過(guò)表達(dá)LXRs能夠抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，其中LXRα具有