慢病毒介導(dǎo)的TIPE2表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究慢病毒介導(dǎo)的腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8樣蛋白2（TNFAIP8L2，TIPE2）表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制。
　　方法：以攜帶人TIPE2編碼序列（CDS）的pMD19-T/TIPE2重組克隆質(zhì)粒為模板，利用人TIPE2特異性引物（TIPE2-F1：5’-GAA GCT AGC GCC ACC ATG GAG TCC TTC AGC TCA AAG-3’；TIPE2-R1：5’-ATA GGC

2、GCG CCT CAG AGC TTC CCT TCG TCT AGC AGC-3’）通過PCR擴(kuò)增約555bp的TIPE2 CDS目的片段，在NheI、SgsI酶切位點(diǎn)間插入至GFP標(biāo)記的pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建人TIPE2重組慢病毒質(zhì)粒pLenti6.3/TIPE2/IRES/GFP，并經(jīng)PCR、雙酶切、DNA測(cè)序鑒定。然后將構(gòu)建正確的pLenti6.3/TIPE2/IRES/GFP及其對(duì)照pLenti6.

3、3/IRES/GFP慢病毒質(zhì)粒分別與輔助包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2、VSVG用脂質(zhì)體Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染293T人胚腎細(xì)胞包裝GFP標(biāo)記的人TIPE2重組慢病毒（LV-TIPE2）及其對(duì)照空病毒（LV），并將慢病毒上清高速離心濃縮后，用有限稀釋法根據(jù)GFP表達(dá)進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定。利用人TIPE2特異性引物（TIPE2-F2：5’-TGA CGG CAC TTA GCT TTG GT-3’；TIPE2-R2：5’-GC

4、A GAC CTG GGT CAG AGA AG-3’）實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR的方法檢測(cè)人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞（A549、SPC-A1、H358、H1299、H292、H1650）及正常支氣管上皮細(xì)胞（HBE）中TIPE2的表達(dá)水平。LV-TIPE2、LV然后分別以25MOI最佳感染劑量感染H1299、H292 NSCLC細(xì)胞，通過10μg/ml的滅瘟素（BSD）篩選后獲得H1299-LV-TIPE2（簡(jiǎn)寫為H1299-TIP

5、E2）、H1299-LV（簡(jiǎn)寫為H1299-mock）；H292-LV-TIPE2（簡(jiǎn)寫為H292-TIPE2）、H292-LV（簡(jiǎn)寫為H292-mock）。上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及慢病毒未感染的H1299、H292細(xì)胞通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP分析轉(zhuǎn)基因效率，及RT-PCR、Western blot檢測(cè)慢病毒介導(dǎo)的TIPE2表達(dá)。利用MTT、PI單染法細(xì)胞周期、Annexin V-PE/7-AAD雙染法細(xì)胞凋亡、Transwell遷

6、移、Transwell侵襲等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)慢病毒介導(dǎo)的TIPE2過表達(dá)對(duì)H1299、H292 NSCLC細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞周期、凋亡、遷移、侵襲的影響。建立BALB/c裸鼠NSCLC皮下移植瘤模型，監(jiān)測(cè)腫瘤體積、重量，分析TIPE2對(duì)H1299、H292 NSCLC細(xì)胞裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的作用。并建立BALB/c裸鼠NSCLC尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型，檢測(cè)TIPE2對(duì)H1299、H292 NSCLC細(xì)胞裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移的作用。并采用Western blot

7、檢測(cè)TIPE2對(duì)H1299、H292 NSCLC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（p21、p27）、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak）、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail1、Snail2/Slug）、激酶相關(guān)蛋白（AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β、p-GSK3β）表達(dá)的影響。并進(jìn)一步用GSK3β抑制劑（VIII）、26S蛋白酶

8、體抑制劑（MG132）開展激酶、蛋白酶體抑制實(shí)驗(yàn)闡明TIPE2調(diào)控AKT-GSK3β-Snail軸促進(jìn)泛素化蛋白酶體降解、下調(diào)Snail1、Snail2（Slug）是TIPE2逆轉(zhuǎn)NSCLC EMT、抑制NSCLC轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制。
　　結(jié)果：1）成功構(gòu)建了人TIPE2重組慢病毒（LV-TIPE2）；2）TIPE2在人NSCLC細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，在H1299、H292 NSCLC細(xì)胞表達(dá)更低；3）成功構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的TIPE

9、2轉(zhuǎn)基因H1299、H292 NSCLC細(xì)胞；4）慢病毒介導(dǎo)的TIPE2過表達(dá)能夠明顯抑制H1299、H292 NSCLC細(xì)胞體外和裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)；5）TIPE2能夠通過上調(diào)p27細(xì)胞周期素依賴激酶（CDK）抑制劑顯著誘導(dǎo)H1299、H292 NSCLC細(xì)胞G1細(xì)胞周期阻滯；6）TIPE2能夠上調(diào)促凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-XL）/抗凋亡蛋白（Bax、Bak）的比例誘導(dǎo)H1299、H292 NSCLC細(xì)胞凋亡；7）TIPE2能夠明顯抑

10、制H1299、H292 NSCLC細(xì)胞體外遷移、侵襲及裸鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移能力；8）TIPE2能夠明顯下調(diào)H1299、H292 NSCLC細(xì)胞Snail1、Snail2（Slug）EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs），N-cadherin、Vimentin間充質(zhì)標(biāo)志物及上調(diào)E-cadherin上皮標(biāo)志物；9）TIPE2能夠明顯下調(diào)H1299、H292 NSCLC細(xì)胞p-AKT、p-GSK3β的水平；10）GSK3β、蛋白酶體抑制后均能完全削

11、弱TIPE2抑制H1299、H292 NSCLC細(xì)胞Snail1、Snail2（Slug）的作用。
　　結(jié)論：1）TIPE2能夠通過下調(diào)AKT信號(hào)、上調(diào)G1期檢查點(diǎn)關(guān)鍵分子誘導(dǎo)G1期阻滯及上調(diào)Bcl-2家族促凋亡蛋白/抗凋亡蛋白的比例活化內(nèi)源性凋亡抑制NSCLC生長(zhǎng)；2）TIPE2能夠通過下調(diào)Snail1和Snail2（Slug）EMT-TFs逆轉(zhuǎn)NSCLC EMT、抑制NSCLC轉(zhuǎn)移；3）TIPE2調(diào)控AKT-GSK3β-Sna