自噬在高糖高脂對(duì)H9c2心肌細(xì)胞凋亡中的影響.pdf

1、目的：
　　自噬在糖尿病心肌病損傷中的作用至今不詳。本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞，建立糖尿病心肌病心肌肥大模型，觀察高糖高脂對(duì)細(xì)胞損傷包括細(xì)胞凋亡的影響；探究自噬在高糖高脂誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中對(duì)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)分三部分：（1）采用隨機(jī)數(shù)表法將體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分組：對(duì)照組、不同濃度高糖高脂（250μM、500μM、1000μM）分別干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞不同時(shí)間組（1

2、2 h、24 h、36 h、48 h），進(jìn)行HE染色，通過(guò)測(cè)量心肌細(xì)胞表面積的方法觀察高糖高脂對(duì)H9c2心肌細(xì)胞肥大的影響；RT-PCR法檢測(cè)心肌肥大標(biāo)記基因ANP和α-SKA表達(dá)水平；（2）采用隨機(jī)數(shù)表法將H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行分組（同第一部分），運(yùn)用乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)方法評(píng)估細(xì)胞損傷程度；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）檢測(cè)細(xì)胞活性和凋亡率；（3）結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用隨機(jī)數(shù)表法將體外培養(yǎng)的H9c2心

3、肌細(xì)胞隨機(jī)分組：對(duì)照組、500μM高糖高脂干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞36 h組（HGHL組）、自噬抑制劑氯喹預(yù)處理高糖高脂干預(yù)組(CQ+HGHL組），應(yīng)用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3 II和細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白cleaved csapase-3表達(dá)水平，觀察自噬在糖尿病心肌病心肌細(xì)胞肥大中對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；應(yīng)用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)對(duì)照組以及高糖高脂干預(yù)組（500μM組）自噬指標(biāo)LC3

4、II以及自噬信號(hào)通路p62/SQSTM1（p62）、Beclin-1、溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1、LAMP2蛋白表達(dá)水平，探究自噬流在高糖高脂對(duì)心肌細(xì)胞凋亡中的影響。
　　結(jié)果：
　　1.高糖高脂處理可顯著誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞肥大，呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。與對(duì)照組相比，HGHL（500μM）處理36 h時(shí)細(xì)胞表面積顯著增加（P<0.05），同時(shí)心肌肥大標(biāo)記基因ANP、α-SKA表達(dá)顯著增加（P<0.01）。
　　2.高糖高

5、脂處理可損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷程度、細(xì)胞凋亡率均明顯增加，呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性，HGHL（500μM）干預(yù)36 h時(shí)細(xì)胞凋亡率約50％（P<0.05）。
　　3.自噬流在高糖高脂誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，與對(duì)照組相比，高糖高脂干預(yù)組（HGHL組）cleaved csapase-3蛋白表達(dá)水平增加（P<0.05），而使用自噬抑制劑氯喹預(yù)處理心肌細(xì)胞1 h后，與對(duì)照組及高糖高脂組（HGHL組）相比，氯喹預(yù)處理組（CQ+HGHL

6、組）細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.05）；自噬流水平在高糖高脂干預(yù)下發(fā)生顯著變化，與對(duì)照組相比，高糖高脂干預(yù)組（500μM組）LC3 II蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.01），Beclin-1、LAMP1、LAMP2蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.05），而p62蛋白水平顯著升高（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.高糖高脂誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞肥大具有一定時(shí)間及濃度依賴(lài)性，提示高糖高脂在誘導(dǎo)糖尿病性心肌病心肌損傷及發(fā)病和疾病進(jìn)展過(guò)程中