血管內(nèi)皮生長因子降低凍存后內(nèi)皮生長暈細(xì)胞凋亡率與PI3K-PKB-Akt-Bad信號(hào)通路的關(guān)系.pdf

1、目的:研究血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)降低低溫凍存內(nèi)皮生長暈細(xì)胞(EOCs)凋亡率與PI3K-PKB/Akt-Bad信號(hào)通路的關(guān)系。
　　 方法:采用密度梯度離心法分離40ml臍血中的單個(gè)核細(xì)胞，每20ml臍血中提取的單個(gè)核細(xì)胞接種至一個(gè)人纖維連接蛋白預(yù)先包被的25cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10％胎牛血清(FBS)EGM-2培養(yǎng)基4ml，培養(yǎng)24h后吸棄上清，PBS輕柔吹洗后加入4m1培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。此后7天內(nèi)每24h更換一

2、半培養(yǎng)液，7天后每72h更換全部全液，并在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。待細(xì)胞形成鋪路石樣結(jié)構(gòu)大于兩個(gè)低倍鏡視野時(shí)，以1∶2進(jìn)行傳代，擴(kuò)增后取第二代細(xì)胞通過免疫組織化學(xué)法、免疫熒光法鑒定內(nèi)皮細(xì)胞特性。第二代細(xì)胞培養(yǎng)48h，生長狀態(tài)良好，70％-80％匯合時(shí)，分為以下4組:①BC組（空白對(duì)照組）:wortmannin溶解液（按DMSO∶PBS為1∶8配置的液體）干預(yù)24h后常規(guī)凍存;②V組（50μg/LVEGF凍存組）:wortman

3、nin溶解液（按DMSO∶PBS為1∶8配置的液體）干預(yù)24h，凍存時(shí)凍存液中加入50μg/LVEGF;③W組（wortmannin干預(yù)24h凍存組）終濃度為inmol/Lwortmannin溶液干預(yù)24h后常規(guī)凍存④W+V（wortmannin干預(yù)24h再加50μg/LVEGF凍存組）:終濃度為lnmol/L的wortmannin溶液干預(yù)24h，凍存時(shí)凍存液中加入50μg/LVEGF。24小時(shí)后復(fù)蘇各組細(xì)胞，Annexin V-FIT

4、C和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)雙染色法通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率，Wester Blot技術(shù)檢測(cè)蛋白p-Akt、Bad、Caspase3的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.密度梯度離心法分離體外培養(yǎng)的EOCs第二代細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)法及免疫熒光法鑒定結(jié)果顯示具備內(nèi)皮細(xì)胞特性。
　　 2.在wortmannin未干預(yù)組中，早期凋亡率V組較BC組降低（P＜0.05）;P-Akt表達(dá)V組較B

5、C組上調(diào)（P＜0.05）;Bad表達(dá)V組較BC組下調(diào)（P＜0.05）;Caspase3表達(dá)V組較BC組下調(diào)（P＜0.05);
　　 3.在加入50μg/L VEGF凍存組中，早期細(xì)胞凋亡率W+V組較V組升高（P＜0.05）;P-Akt表達(dá)W+V組較V組下調(diào)（P＜0.05）;Bad表達(dá)W+V組較V組上調(diào)（P＜0.05）;Caspase3表達(dá)W+V組較V組W+V組較V組上調(diào)（P＜0.05）;
　　 4.在未加入VEGF凍存組

6、中，早期細(xì)胞凋亡率W組較BC組升高（P＜0.05）;p-Akt表達(dá)W組較BC組降低（P＜0.05）;Bad表達(dá)W組較BC組升高（P＜0.05);Caspase3表達(dá)W組較BC組升高（P＜0.05);
　　 5.在wortmannin干預(yù)組中，早期細(xì)胞凋亡率W組較W+V組升高（P＜0.05）;P-Akt表達(dá)W組與W+V組無明顯差異（P＞0.05）;Bad表達(dá)W組與W+V組無明顯差異（P＞0.05）;Caspase3表達(dá)W組與W+V