BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)后上清液對(duì)MCI大鼠治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 探討3代、4代、5代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)后12h上清液對(duì)認(rèn)知功能障礙大鼠的治療作用。
　　 方法：
　　 1、大鼠BMSC的分離、培養(yǎng)和鑒定BMSC采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，用流式細(xì)胞儀對(duì)選取的第3代BMSC，按105/mL水平分別置于5個(gè)檢測(cè)管后加入小鼠抗大鼠CD29抗體、CD44抗體、CD34抗體以及用于對(duì)照的IgGI和空白對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)。2、細(xì)胞爬片和誘導(dǎo)與鑒定分別取第3、4、5代BM

2、SC進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，具體方法為：六孔板中加入含1mmol/LβME和20％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液。24h后吸棄預(yù)誘導(dǎo)液。加入bFGF20ng/mL和10％胎牛血清。后行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與處理3月齡大鼠十只為正常組，Morris水迷宮行隱蔽平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)確立認(rèn)知功能障礙大鼠標(biāo)準(zhǔn)：平均潛伏期較正常組延長(zhǎng)20％以上者定義為認(rèn)知功能障礙大鼠。15-22月齡大鼠Morris水迷宮行隱蔽平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)篩選認(rèn)知功能障礙大鼠40只，隨

3、機(jī)分生理鹽水對(duì)照組、3代、4代、5代干細(xì)胞傳代誘導(dǎo)后12小時(shí)上清液治療組并行行為學(xué)檢測(cè)，后分別海馬注射生理鹽水、三代、四代、五代干細(xì)胞傳代誘導(dǎo)后12小時(shí)上清液3μ(1)。注射上清后4周4組大鼠進(jìn)再次行行為學(xué)檢測(cè)。4、免疫組織化學(xué)染色測(cè)定CDK5表達(dá)程度。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功分離培養(yǎng)BMSC，傳至3代后，細(xì)胞呈旋渦狀排列的均一梭形，流式細(xì)胞儀檢測(cè)符合MCS表型特征：檢測(cè)CD29表達(dá)率為(99.7％)、CD44表達(dá)

4、率為(99.8％)、CD34表達(dá)率為(2.3％)。2、誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化與免疫化學(xué)鑒定加入預(yù)誘導(dǎo)液24h后可以觀察到一部分細(xì)胞胞膜胞質(zhì)漸進(jìn)性向胞核方向集中、收縮，移入bFGF后上述變化更加明顯，可見(jiàn)突起形成。各組細(xì)胞均有部分細(xì)胞NSE陽(yáng)性，表現(xiàn)為胞漿呈黃棕色，陽(yáng)性率為42.50±6.40，GFAP染色后各誘導(dǎo)組出現(xiàn)極少量陽(yáng)性細(xì)胞。3、水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)注射前后定位巡航實(shí)驗(yàn)潛伏期差值行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，除三代組與五代組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其它任

5、何兩組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，三代與五代上清液較四代效果明顯。4、各組腦組織邊緣系統(tǒng)CDK5表達(dá)情況Kruskal-Wallis檢驗(yàn)可認(rèn)為四組CDK5表達(dá)情況總體分布不同或不全相同(X2=32.046，P＜0.001)，進(jìn)一步應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分別對(duì)四組行組間兩兩比較，除三代組與五代組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三代（平均秩和=5.50）與五代（平均秩和=5.50）上清液組較四代(平均秩