SD大鼠NPMSC和BMSC在體外誘導(dǎo)條件下向軟骨細(xì)胞分化能力的研究.pdf

1、隨著下腰痛的發(fā)病率越來越高，治療這種疾病已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)界面臨的一個(gè)醫(yī)療和社會(huì)難題。研究發(fā)現(xiàn)下腰痛是由許多原因造成的，包括外傷，椎間盤退變，椎間盤突出，椎管狹窄等。而椎間盤退變被認(rèn)為是下腰痛的主要原因。椎間盤退變表現(xiàn)為：髓核細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的減少，椎間盤結(jié)構(gòu)的破壞。許多因素包括：基因、不良生活習(xí)慣、重體力勞動(dòng)和其他的身體機(jī)能紊亂等都可能導(dǎo)致椎間盤退變。
　　目前的治療椎間盤退變方法有：藥物治療、類固醇注射、理療、椎間盤切除、脊柱融

2、合術(shù)等。這些方法只能減輕臨床癥狀，還不能治愈和阻止椎間盤退變的過程。因此，提出來許多新的治療和逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的方法。這些方法集中在修復(fù)再生髓核細(xì)胞，并取得了一定的研究進(jìn)展。第一種新療法是分子治療，利用基因產(chǎn)物調(diào)控合成代謝和降解途徑從而抑制或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。第二種新療法是細(xì)胞治療，結(jié)合組織工程技術(shù)，通過恢復(fù)或更換退變椎間盤中減少和衰老的髓核細(xì)胞來達(dá)到治療的目的。目前用到的種子細(xì)胞有從骨髓、脂肪、臍帶等組織提取出來的干細(xì)胞，還有同源性軟骨細(xì)

3、胞和髓核細(xì)胞等。
　　最近Blanco報(bào)道從退變椎間盤組織中分離培養(yǎng)出一些細(xì)胞，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)這類細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD29、CD90、CD73、CD105、CD166、CD106，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45、CD14、CD19，并與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)無明顯不同，并且具有成骨、成軟骨的分化能力，而無成脂分化能力。符合國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)（the Mesenchymal and Ti

4、ssue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy, ISCT）中有關(guān)多能間充質(zhì)干細(xì)胞的界定標(biāo)準(zhǔn)。從髓核分離的干細(xì)胞，來源于髓核組織，相對(duì)于其他組織來源的干細(xì)胞更能適應(yīng)椎間盤的內(nèi)環(huán)境。但髓核干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、增值能力、成骨成脂成軟骨分化能力上有什么區(qū)別，還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)從SD大鼠的髓核組織中提取了髓核干細(xì)胞

5、，并進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。比較髓核干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞形態(tài)，增值能力和分化能力。比較髓核干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)條件下成軟骨能力有何區(qū)別。
　　本實(shí)驗(yàn)共分為三部分：
　　第一部分 NPMSC的分離培養(yǎng)鑒定
　　目的：
　　本部分實(shí)驗(yàn)從SD大鼠髓核組織中分離和培養(yǎng)髓核干細(xì)胞，并通過細(xì)胞形態(tài)、干細(xì)胞基因、干細(xì)胞表面標(biāo)記物，以及成骨、成脂、成軟骨分化能力進(jìn)行鑒定。
　　材料和方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　選

6、用由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供體重250±10g的健康雄性SD大鼠。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1、NPMSC分離培養(yǎng)
　　在無菌條件下應(yīng)用顯微鏡從每個(gè)SD大鼠尾巴的椎間盤內(nèi)分離髓核組織。經(jīng)過0.2％II型膠原酶和0.25%胰蛋白酶處理后，用含有20%胎牛血清和青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　2.2、NPMSC細(xì)胞形態(tài)觀察
　　NPMSC培養(yǎng)到第三代進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。
　　2.3、PC

7、R檢測(cè)NPMSC干細(xì)胞基因檢測(cè)
　　收集第三代NPMSC應(yīng)用Trizol提取總RNA。PCR檢測(cè)Nanog、Sox2、Oct-4干細(xì)胞基因的表達(dá)。
　　2.4、PCR檢測(cè)NPMSC干細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)
　　PCR檢測(cè)CD44、CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、HLA-DR干細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。
　　2.5、NPMSC成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化
　　NPMSC在體外誘導(dǎo)條件下向骨

8、、脂肪、軟骨分化。觀察NPMSC的多向分化能力。
　　結(jié)果：
　　1. SD大鼠髓核組織中可以分離培養(yǎng)NPMSC。
　　2.第三代NPMSC形態(tài)基本保持一致為紡錘樣長梭形。
　　3. NPMSC表達(dá)干細(xì)胞基因Nanog、Sox2、Oct-4。
　　4. NPMSC表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD105、CD73、CD90，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45、CD34、CD14、HLA-DR。
　　5

9、. NPMSC具有成骨、成脂、成軟骨多向分化能力。
　　結(jié)論一：
　　從SD大鼠的髓核組織中可以分離培養(yǎng)出紡錘樣長梭形細(xì)胞，表達(dá)干細(xì)胞基因Nanog、Sox2、Oct-4，表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD105、CD73、CD90，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45、CD34、CD14、HLA-DR，具有成骨、成脂、成軟骨多向分化能力的NPMSC。
　　第二部分 NPMSC和BMSC增殖能力和多向分化能力的比較

10、>　　目的：
　　分離培養(yǎng)SD大鼠NPMSC和BMSC，比較兩種干細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖能力、干細(xì)胞基因表達(dá)、干細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)、成骨成脂成軟骨分化能力，以及誘導(dǎo)后成骨、成脂、成軟骨基因的表達(dá)。
　　材料和方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　選用由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供體重250±10g的健康雄性SD大鼠。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1、 NPMSC和BMSC分離培養(yǎng)
　　分別從SD大鼠的椎間盤髓

11、核組織和長骨骨髓中分離培養(yǎng)NPMSC和BMSC。
　　2.2、 NPMSC和BMSC細(xì)胞形態(tài)觀察
　　NPMSC、BMSC培養(yǎng)到第三代進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。
　　2.3、 NPMSC和BMSC細(xì)胞增殖能力檢測(cè)
　　應(yīng)用CCK-8法分別檢測(cè)第三代NPMSC和BMSC在第0、1、3、5、7、9天的細(xì)胞增殖能力。
　　2.4、 PCR檢測(cè)NPMSC和BMSC干細(xì)胞基因檢測(cè)
　　收集第三代NPMSC、BMSC應(yīng)

12、用Trizol提取總RNA。PCR檢測(cè)Nanog、Sox2、Oct-4干細(xì)胞基因的表達(dá)。
　　2.5、 PCR檢測(cè)NPMSC和BMSC干細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)
　　PCR檢測(cè)第三代NPMSC和BMSC中CD44、CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、HLA-DR干細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。
　　2.6、 NPMSC和BMSC成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化
　　NPMSC、BMSC在體外誘導(dǎo)條件下向骨、

13、脂肪、軟骨分化。觀察NPMSC、BMSC的多向分化能力。
　　2.7、 PCR檢測(cè)NPMSC和BMSC成骨、成脂、成軟骨基因的表達(dá)
　　PCR檢測(cè)NPMSC和BMSC誘導(dǎo)后成骨、成脂、成軟骨基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. SD大鼠髓核組織和骨髓中分離培養(yǎng)NPMSC和BMSC。
　　2.第三代NPMSC和BMSC形態(tài)基本一致均為紡錘樣長梭形。
　　3.第三代NPMSC和BMSC在增殖能力上相近。

14、r>　　4. NPMSC和BMSC均表達(dá)干細(xì)胞基因Nanog、Sox2、Oct-4。
　　5. NPMSC和BMSC表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD105、CD73、CD90，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45、CD34、CD14、HLA-DR。
　　6. NPMSC和BMSC具有成骨、成脂、成軟骨多向分化能力。
　　7. NPMSC和BMSC誘導(dǎo)后均表達(dá)成骨、成脂、成軟骨基因。
　　結(jié)論二：
　　SD大

15、鼠髓核組織中分離培養(yǎng)的NPMSC和長骨骨髓中分離培養(yǎng)的BMSC在細(xì)胞學(xué)形態(tài)、增殖能力上一致，均表達(dá)干細(xì)胞基因，表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物，具有成骨、成脂、成軟骨能力，誘導(dǎo)后表達(dá)成骨、成脂、成軟骨基因。
　　第三部分 NPMSC和BMSC成軟骨能力的比較
　　目的：
　　應(yīng)用PCR、RT-PCR、Western-blotting等方法檢測(cè)NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后II型膠原、蛋白聚糖、SOX9

16、基因和蛋白表達(dá)。比較兩種干細(xì)胞在成軟骨能力上的差異。
　　材料和方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　選用由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供體重250±10g的健康雄性SD大鼠。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1、 NPMSC和BMSC在體外誘導(dǎo)條件下向軟骨細(xì)胞分化
　　三代干細(xì)胞2.5×105個(gè)離心后，加入1ml新鮮的完全成軟骨誘導(dǎo)液（1ml不完全成軟骨誘導(dǎo)液+10μTGF-?3），在成軟骨誘導(dǎo)第21 d的時(shí)候，收

17、集細(xì)胞。
　　2.2、 PCR檢測(cè)II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因的表達(dá)
　　分別提取NPMSC和BMSC誘導(dǎo)前后細(xì)胞的總RNA，應(yīng)用PCR檢測(cè)II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因的表達(dá)。
　　2.3、 RT-PCR檢測(cè)II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因的表達(dá)
　　分別提取NPMSC和BMSC誘導(dǎo)前后細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用RT-PCR定量檢測(cè)II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因的表達(dá)。
　　2.4、 W

18、estern-blotting檢測(cè)II型膠原、蛋白聚糖、SOX9蛋白的表達(dá)
　　分別提取NPMSC和BMSC誘導(dǎo)前后細(xì)胞的總蛋白，應(yīng)用Western-blotting定量檢測(cè)II型膠原、蛋白聚糖、SOX9蛋白的表達(dá)
　　結(jié)果：
　　1. NPMSC和BMSC在體外誘導(dǎo)條件下均可以向軟骨分化。
　　2. NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后PCR檢測(cè)II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因表達(dá)均增高，兩者之間表達(dá)無差異。

19、r>　　3. NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后RT-PCR定量檢測(cè)II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因表達(dá)均增高，兩者之間表達(dá)無差異。
　　4. NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后Western-blotting定量檢測(cè)II型膠原、蛋白聚糖、SOX9蛋白表達(dá)均增高，兩者之間表達(dá)無差異。
　　結(jié)論三：
　　NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后，經(jīng)PCR、RT-PCR、Western-blotting檢測(cè)II型膠原、蛋白聚糖、SO