納米級(jí)膠原基骨材料復(fù)合自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞用于兔后外側(cè)脊柱融合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)的分離、培養(yǎng)、多系誘導(dǎo)分化及與納米級(jí)膠原基骨材料(nHAC/PLA)復(fù)合的研究
　　 目的:分離和培養(yǎng)兔ADMSCs,并鑒定其多系分化潛能。與nHAC/PLA復(fù)合,檢測(cè)細(xì)胞在支架材料上的活性和增殖速率。
　　 方法:脂肪組織取自成年新西蘭白兔腹股溝處脂肪墊,采用Ⅰ型膠原酶消化分離出ADMSCs,基礎(chǔ)培養(yǎng)基傳代至P2改用誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),在體外進(jìn)行ADMSCs的成脂肪、成骨、成軟

2、骨的誘導(dǎo)分化。成脂肪的誘導(dǎo)液組成是10％FBS,0.5 mM isobutyl-methylxanthine(IBMX)，1μMdexamethasone,10μM insulin,200μM indomethacin，1％ antibiotic/antimycotic,誘導(dǎo)2周后用油紅O檢測(cè)誘導(dǎo)結(jié)果。成骨的誘導(dǎo)液組成為10％FBS0.1μMdexamethasone,50μM ascorbate-2-phosphate,10mMβ-g

3、lycerophosphate,1％antibiotic/antimycotic。誘導(dǎo)2周時(shí)用鈣鈷法進(jìn)行ALP的染色,4周時(shí)應(yīng)用茜素紅染鈣化結(jié)節(jié)。應(yīng)用懸浮微球法對(duì)ADMSCs進(jìn)行成軟骨分化的誘導(dǎo),誘導(dǎo)液組成為:6.25μg/ml insulin,10ng/ml TGF-1,50nM ascorbate-2-phosphate,1％antibiotic/antimycotic。誘導(dǎo)2周時(shí),進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫組化染色,番紅O染色和甲苯胺蘭染色

4、。應(yīng)用旋轉(zhuǎn)瓶對(duì)nHAC/PLA支架進(jìn)行細(xì)胞接種,進(jìn)行細(xì)胞接種率,細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖速率的檢測(cè)。
　　 結(jié)果:每25mg脂肪組織分離24h后,可以獲得約1×106ADMSCs,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型或多角形。P2代的ADMSCs用于誘導(dǎo)分化。在成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后,細(xì)胞中可見(jiàn)聚集的脂滴,成空泡狀,油紅O染色陽(yáng)性。在進(jìn)行成骨誘導(dǎo)2周時(shí),ADMSCs行ALP的染色可見(jiàn)ALP的陽(yáng)性表達(dá)。4周時(shí)進(jìn)行茜素紅染色,鈣鹽沉積物被染為紅色顆粒。應(yīng)用懸浮微球

5、法進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)2周時(shí),番紅O染色和甲苯胺蘭染色均為陽(yáng)性表現(xiàn),Ⅱ型膠原免疫組化染色提示ADMSCs表達(dá)軟骨細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)。應(yīng)用旋轉(zhuǎn)瓶接種細(xì)胞,細(xì)胞接種率可達(dá)95％,熒光染色定性檢測(cè)表明細(xì)胞擁有良好的活性。MTT法檢測(cè)表明接種后的細(xì)胞仍保持較快的增殖速率。
　　 結(jié)論:
　　 1.脂肪問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化方法簡(jiǎn)單,增殖迅速,一次分離可以獲得大量的種子細(xì)胞。
　　 2.脂肪干細(xì)胞在特定條件下具有向軟骨、骨及脂

6、肪細(xì)胞分化的潛能。
　　 3.利用旋轉(zhuǎn)瓶可以獲得較高的細(xì)胞接種率,同時(shí)保持細(xì)胞的活性和增殖潛能。
　　 第二部分:ADMSCs復(fù)合nHAC/PLA用于兔脊柱后外側(cè)融合的研究
　　 目的:脊柱融合手術(shù)是治療由椎間盤引起的腰痛的常規(guī)方法。應(yīng)用自體髂骨移植一直是脊柱融合手術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn),但也存在一些不足,比如假關(guān)節(jié)形成、供區(qū)疼痛、手術(shù)時(shí)間長(zhǎng),出血多,術(shù)后需要輸血。本實(shí)驗(yàn)探討應(yīng)用一種新的礦化基質(zhì)骨材料nHAC/PLA結(jié)合AD

7、MSCs用于兔脊柱融合模型的可行性。
　　 方法:40只成年新西蘭白兔被分為4組,自體髂骨移植組(ACB)、單純支架材料移植組(nHAC/PLA)、支架材料加自體骨組(ACB+nHAC/PLA),支架材料復(fù)合ADMSCs(ADMSCs+nHAC/PLA)。10周后,對(duì)融合骨塊進(jìn)行手觸檢查評(píng)估融合程度,X線照射評(píng)估成骨范圍,進(jìn)行機(jī)械拉伸實(shí)驗(yàn),檢測(cè)融合部位力學(xué)強(qiáng)度。制作組織學(xué)標(biāo)本,進(jìn)行組織染色、免疫組織化學(xué)染色,掃描電鏡觀察新生骨組

8、織的超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:ACB組和.ADMSCs+nHAC/PLA組都可實(shí)現(xiàn)較高的融合率,顯著高于nHAC/PLA組和ACB+nHAC/PLA組,ADMSCs+nHAC/PLA組和ACB組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織學(xué)的評(píng)估也表明在ACB組和ADMSCs+nHAC/PLA有更多的骨組織形成。
　　 結(jié)論:我們的研究表明自體ADMSCs結(jié)合nHAC/PLA可以實(shí)現(xiàn)與自體骨移植相似的融合比率,可以作為自體骨移植的替代物用于脊柱