自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)皮注射修復(fù)骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：建立兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的體外培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)體系。對BMSCs的抽取方式進(jìn)行改良，評價BMSCs體外傳代培養(yǎng)時不同培養(yǎng)基對BMSCs增殖能力的影響。比較自體BMSCs、成骨誘導(dǎo)后的BMSCs及二者聯(lián)合經(jīng)皮移植后體內(nèi)成骨能力的差異，評價其經(jīng)皮注射修復(fù)小段骨缺損的療效，為骨組織工程選擇種子細(xì)胞提供依據(jù)，為臨床上治療小段骨缺損以及骨不連提供一個新的思路。

2、 方法： 1．抽取日本大耳白兔骨髓，用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行BMSCs的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增。取第2代BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。定量測定培養(yǎng)液上清ALP活性，找出最強(qiáng)成骨活性的時間窗，并對成骨誘導(dǎo)前后的細(xì)胞增殖能力、成骨活性等生物學(xué)特性進(jìn)行比較。 2．隨機(jī)將16只日本大耳白兔32側(cè)髂部分為4組，前3組用骨穿針取骨髓，第4組用普通一次性20毫升加藥注射器抽取骨髓，分別用α-MEM、DMEF-12、DMEM、DMEM行全骨髓培養(yǎng)法制

3、備BMSCs。比較4組細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶所需天數(shù)及第2代BMSCs生長曲線。 3．制作新西蘭大白兔橈骨中段15mm骨缺損模型，20只兔共40側(cè)骨缺損模型隨機(jī)分為5組，每組8側(cè)。A組經(jīng)皮植入自體1×10<'6>個BMSCs和1×10<'6>個己向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs，B組植入2×10<'6>個已向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs，C組植入2×10<'6>個BMSCs，D組植入纖維蛋白膠復(fù)合5mgBMP，E組為空白對照組。術(shù)后對動物進(jìn)行大體

4、觀察、攝X線片觀察各組不同時相骨缺損修復(fù)情況，比較不同時相的骨缺損區(qū)X線阻射密度、并于術(shù)后第4，8，12周取出骨缺損區(qū)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)切片觀察；取第12周標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)檢測。 結(jié)果： 1．骨髓穿刺針與普通一次性20毫升加藥注射器所取骨髓經(jīng)全骨髓培養(yǎng)法獲得的BMSCs的數(shù)量及細(xì)胞形態(tài)、生長曲線沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 2．α-MEM培養(yǎng)基比：DMEM、DMEF-12行全骨髓培養(yǎng)法制備BMSCs所需時間大大縮短，加

5、入骨誘導(dǎo)成分后成骨誘導(dǎo)效率更高。 3．BMSCs與成骨誘導(dǎo)后的BMSCs聯(lián)合移植組在12周內(nèi)骨缺損區(qū)新生骨的數(shù)量和質(zhì)量顯著優(yōu)于單純移植．BMSCs或單純移植成骨誘導(dǎo)后的BMSCs，空白組骨缺損主要由纖維結(jié)締組織填充。X線顯示術(shù)后4周即可發(fā)現(xiàn)4組動物的橈骨缺損區(qū)域均有明顯骨痂生成，第12周時A組即細(xì)胞聯(lián)合移植組的骨缺損完全愈合，各時相局部x線阻射密度值顯示，A、D組的新生骨痂最多，且可見髓腔再通現(xiàn)象；生物力學(xué)檢測顯示A組橈骨標(biāo)本的