富集骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合nHA-CS材料修復(fù)兔骨缺損的實驗研究.pdf

1、生活節(jié)奏的加快、空間的擴展以及交通事故的頻發(fā)等因素,使骨組織損傷、骨折的發(fā)生率逐年上升,加之骨腫瘤、感染等多種原因?qū)е碌墓侨睋p的修復(fù)一直是骨科臨床工作中普遍存在并亟待解決的一大難題。目前臨床上應(yīng)用最廣泛的主要治療方法有自體骨移植、異體骨移植。但兩種方法都有一些無法避免的局限性和缺點:如自體骨移植的來源有限、增加供體部位感染機率、引起取骨部位的創(chuàng)傷、延長手術(shù)時間等缺點；而異體骨移植有可能傳播疾病、宿主免疫排斥反應(yīng)等。為避免或減少上述問題,

2、應(yīng)用組織工程方法構(gòu)建人工骨修復(fù)材料為骨缺損的修復(fù)提供了希望和可能,尋找一種合適的人工骨缺損修復(fù)材料是近年來骨組織工程的研究熱點。骨組織工程研究中種子細胞和支架材料是最的兩大因素,支架為細胞粘附生長提供可附著的基礎(chǔ),支架需要有效的支持種子細胞的粘附、生長、分化,另外支架材料還具有一定細胞外基質(zhì)功能及適時降解性,二者是相輔相成的。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)作為骨組織工程

3、的種子細胞是目前眾多種子細胞中研究最多的細胞。BMSCs具有多分化潛能,在特定條件下能向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等分化,增殖能力強,來源廣泛,取材方便,供區(qū)損傷小,因而倍受人們的關(guān)注。對骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞周期的研究表明,大約有20％的骨髓間充質(zhì)干細胞處于靜止期,即G0期,這表明骨髓間充質(zhì)干細胞具有強大的增殖能力。研究表明骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)12代仍能保持正常的染色體表型和端粒酶活性,在培養(yǎng)了15代之后仍保持其成骨的分化潛能。

4、組織工程人工骨不僅需要成骨能力強的種子細胞,更需要適宜的人工細胞外基質(zhì)(即細胞載體)材料。由于骨組織的特殊生理結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能,對骨組織工程細胞外基質(zhì)材料有特殊要求,理想的骨組織工程支架材料應(yīng)具備以下條件:①有良好的生物相容性,有利于復(fù)合及周圍細胞的粘附、增殖、無毒、不致畸,不引起炎癥反應(yīng)。②有效的表面活性,有利于細胞粘附、并為細胞在其表面生長、增殖和分泌基質(zhì)提供良好的微環(huán)境,能激活細胞特異性基因表達,維持正常細胞的表型表達。③具有三維多

5、孔結(jié)構(gòu),材料具有多空性和孔隙率,孔隙率最好在90％以上,內(nèi)表面積大,既有利于細胞的粘附和長入,又利于營養(yǎng)成分代謝產(chǎn)物的排出。④一定的可塑性:便于加工成所需要的形狀,并具有一定的機械強度,從而使所形成的組織具有所需的外形。⑤適宜的生物降解性:材料的降解速率應(yīng)與組織細胞的生長速率相適應(yīng),應(yīng)能根據(jù)組織生長特性逐步降解。生物類材料中的同種異體骨和異種骨兩者都存在免疫原性問題,及降解過快等缺點。生物陶瓷類材料磷酸三鈣(TCP)、生物活性玻璃陶瓷(

6、BGC)、雙相鈣磷陶瓷(HA/TCP)為代表,具有良好的成骨能力,但存在脆性大、降解慢等缺陷,影響新生骨替代進程和骨組織后期改建。有機材料有著良好的生物相容性、可降解性可吸收性、材料的吸收率可控制等優(yōu)點,但親水性差,細胞吸附力較弱,材料表面缺乏細胞識別信號,與細胞間缺乏生物性相互作用,聚合物中殘留的有機溶劑可引起細胞毒副作用:天然材料生物相容性好,具有細胞識別信號,利于細胞黏附增殖:人工材料缺乏細胞信號,但具有天然材料所不足的可以大規(guī)模

7、生產(chǎn)、可以設(shè)計和控制結(jié)構(gòu)、機械性能和降解時間等優(yōu)點。可見,單一類型材料一般難以滿足骨組織工程支架材料的要求,通過合適的方法將單一的生物陶瓷類與有機物材料結(jié)合,互相取長補短,形成復(fù)合型材料,在實際應(yīng)用中取得了良好的效果。
　　 可注射性納米羥基磷灰石/殼聚糖(nano-Hydr0Xyapatite/chitosan,nHA/CS)復(fù)合材料是具有良好骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)性的納米材料,最大的特點為高比表面積和空隙率,有利于細胞接種、遷移和增

8、殖。因為貼壁依賴型細胞只有在材料上黏附后,才能生長和分化。其孔隙率90％,孔徑50—300μ m該材料具有較好的初始穩(wěn)定性和強度,既可以原位成形固化,又可以塑形,研究表明其同時具備有羥基磷灰石的和殼聚糖的特性,經(jīng)過前期的實驗研究證實可注射性nHh/CS具有良好的生物相容性。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)的成骨分化能力早已為人們熟知。
　　 本實驗研究擬在體外培養(yǎng)BMSCs,并與

9、nHA/CS復(fù)合培養(yǎng),驗證該復(fù)合材料的生物相容性基礎(chǔ)上,制作兔股骨髁骨缺損動物模型,富集骨髓間充質(zhì)干細胞與nHA/CS支架材料復(fù)合,對該復(fù)合物對促進骨缺損修復(fù)中的作用進行評估,為富集BMSCs—nHA/CS復(fù)合物在骨組織工程臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)及可行性依據(jù)。
　　 內(nèi)容:
　　 1、第一部分可注射性nHA/CS復(fù)合材料與骨髓間充質(zhì)干細胞生物相容性研究。采用密度梯度離心法獲得兔原代骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow

10、StemCells,BMSCs),體外培養(yǎng)并將傳至第3代的骨髓間充質(zhì)干細胞與可注射性納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料共同培養(yǎng),觀察細胞與該材料的生長增值情況及生物相容性。
　　 2、第二部分富集骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合nHA/CS修復(fù)兔骨缺損的實驗研究。建立兔股骨髁上骨缺損模型,富集第3代骨髓間充干細胞,負壓條件下將第3代BMSCs與nHA/CS材料復(fù)合,將富集BMSCs—nHA/CS復(fù)合物植入兔股骨髁上骨缺損內(nèi),術(shù)后不同時間點取材后

11、大體、組織學(xué)觀察該復(fù)合物對骨缺損的修復(fù)效果。
　　 方法:
　　 1、可注射性nHA/CS復(fù)合材料與骨髓間充質(zhì)干細胞生物相容性實驗方法:
　　 采用全骨髓穿刺法從3周齡健康新西蘭大白兔股骨和脛骨骨髓中抽取原代兔骨髓,密度梯度離心法獲取原代骨髓間充質(zhì)干細胞,培養(yǎng)鑒定后,體外培養(yǎng)并將穩(wěn)定的傳至第3代,按一定濃度接種到納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料上,體外共同培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡、電鏡觀察接種到材料上的細胞形態(tài)及細胞在

12、材料上附著情況,CCK-8法測定細胞活性,并計數(shù)細胞接種后2、4、8、12h在材料表面的黏附狀況。并對誘導(dǎo)培養(yǎng)后細胞進行堿性磷酸酶活性測定。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,結(jié)果用(x)±s表示,P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同一時間點兩組細胞粘附數(shù)采用兩獨立樣本t檢驗；同組不同時間點應(yīng)用多個樣本均數(shù)比較的方差分析(One-way ANOVA),組間多重比較采用LSD法。
　　 2、富集骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合nHA/CS修復(fù)兔骨

13、缺損的實驗方法:
　　 36只成年新西蘭白兔,體重為1.5-2.0kg,按隨機數(shù)字法隨機分為3組:4周組、8周組、12周組(每組12只)。兔雙側(cè)股骨髁上建立直徑為7mm,深度為10mm骨缺損空腔,將BMSCs-nHA/CS復(fù)合物植入右側(cè)骨缺損作為實驗組,左側(cè)植入單純nHA/CS材料作為對照組,其中每組中4只兔兩側(cè)骨缺損不植入任何材料作為空白對照組。分別于4、8、12周末取材觀察:①大體觀察材料植入后動物的生命活動狀況,并觀察標(biāo)本

14、骨缺損修復(fù)愈合狀況；②X線、CT橫斷面掃描及三維重建進一步通過影像學(xué)對骨缺損愈合狀況進行評估；③骨密度值測量比較實驗組對照組的差異情況。④組織學(xué)切片觀察骨缺損處與材料交界部位新生骨形成,材料降解及骨缺損愈合的組織學(xué)變化過程；
　　 結(jié)果:
　　 1、可注射性nHA/CS復(fù)合材料與骨髓間充質(zhì)干細胞生物相容性實驗結(jié)果:
　　 ①倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細胞圍繞在nHA/CS復(fù)合材料邊緣生長,隨著時間的遞增,細

15、胞數(shù)目逐漸增加,生長狀況良好。
　　 ②電鏡檢測發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞粘附在nHA/CS材料表面上生長良好,部分細胞伸出偽足長入材料孔隙里。
　　 ③黏附數(shù)測定結(jié)果表明,細胞接種到納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料2h時兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000),材料組黏附數(shù)低于對照組；但接種4 h,8h,12h后兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.91、0.084、0.081),材料組細胞粘附數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。<

16、br>　　 ④CCK-8法測定細胞活性:細胞密度從最初培養(yǎng)到7天至平臺期后達到最大。材料組和對照組在最初7天均呈相同的逐漸增長趨勢,第7天時達到最大值。細胞和材料共同培養(yǎng)后增殖細胞沒有明顯改變,nHA/CS對細胞的生長及增值活性沒有明顯影響。
　　 2、富集骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合nHA/CS修復(fù)兔骨缺損的研究結(jié)果:
　　 所有實驗兔術(shù)后2天后完全恢復(fù)正常飲食水。5天后手術(shù)切口均Ⅰ期愈合,兔活動狀態(tài)如術(shù)前。觀察期間兔下肢未

17、出現(xiàn)感染現(xiàn)象。
　　 ①大體觀察:實驗組:4周后尚可見缺損區(qū)域,纖維組織覆蓋缺損區(qū)；8周后缺損區(qū)凹陷變平整,表面光滑,有光澤,按壓移植部位可有部分阻抗；12周后骨缺損區(qū)域完全修復(fù),股骨形狀基本恢復(fù)到術(shù)前形態(tài),按壓移植部位阻抗與周邊正常骨組織相似。對照組:4周后缺損區(qū)可見；8周后缺損區(qū)與周圍界限變模糊,表面欠光滑,顏色稍暗,按壓移植部位稍有阻抗；術(shù)后12周骨缺損區(qū)域與周圍界限不能分辨,色澤與周圍無明顯差異,按壓移植部位有一定的阻抗

18、,但有部分骨皮質(zhì)缺損,僅纖維組織填充?？瞻捉M:4周后缺損腔仍在,纖維結(jié)締組織覆蓋缺損；8周后缺損區(qū)見肉芽組織填充空腔,缺損區(qū)沒有阻抗,按壓即部分塌陷。12周缺損區(qū)見大量肉芽部分填充缺損修復(fù)效果差。
　　 ②X線、CT檢查結(jié)果:
　　 實驗組:4周時材料與正常骨組織之間有一環(huán)狀的界限,缺損仍可見；8周時正常骨組織與材料界限模糊,缺損區(qū)域透光性稍低于周圍宿主骨組織,正常骨組織與材料界限模糊,外層骨皮質(zhì)已有連接；12周末組骨缺

19、損完全修復(fù),原缺損空腔有新生骨組織,CT顯示缺損修復(fù)區(qū)域與周圍骨組織密度基本相同。
　　 對照組:4周時骨缺損區(qū)域仍可見,材料與周圍組織之間界限尚清晰明顯；8周時缺損區(qū)域較前明顯減小,缺損區(qū)透光性低于周圍宿主骨組織,但外層骨皮質(zhì)不連續(xù)；12周時骨缺損較前進一步減小,骨缺損見部分骨性修復(fù),仍有部分骨皮質(zhì)不連續(xù)。
　　 空白組:4周缺損明顯,未見愈合征象；8周后缺損空腔見纖維組織填充,見肉芽組織填充缺損,未見骨性組織填充；1

20、2周時缺損邊緣見硬化,缺損空腔密度明顯低于骨周圍組織密度,未見明顯骨性成分修復(fù)。
　　 ③12周時CT三維重建:
　　 實驗組:骨缺損已基本完全修復(fù),未見明顯骨缺損空腔；對照組有部分新骨長入,但缺損空腔仍可見,缺損空腔仍存在；空白組修復(fù)效果最差,骨缺損空腔明顯存在。
　　 ④骨密度值測量:隨時間增加,各組骨密度值逐漸增加,4周、8周、12周末時實驗組與對照組及空白組比較骨密度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在

21、各個時間點實驗組骨密度值均大于對照組和空白組,方差分析比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),實驗組骨密度值高于對照組及空白組。
　　 ⑤組織形態(tài)學(xué)觀察:
　　 實驗組:4周時復(fù)合材料與宿主骨交界有少量新骨形成,有纖維骨痂形成,材料與骨組織生物相容性好；8周時出現(xiàn)大量排列較整齊的新生骨小梁,可見成骨細胞生長,并可見少量板層狀樣骨組織,材料有部分降解；12周時可見大量新生板層骨組織,見成骨細胞較多,大量新骨原缺損區(qū)被新生板層

22、骨組織填充,材料大部分降解。
　　 對照組:4周時纖維軟組織長入材料,缺損邊緣可見少量纖維性骨痂形成；8周后,缺損區(qū)有新生成骨細胞,未見板層骨形成,材料部分降解；12周后少量板層樣骨組織形成,但仍有部分骨缺損區(qū)域由纖維組織填充,材料亦大部分降解。
　　 空白組:4周時纖維軟組織長入材料,也可見淋巴細胞等,缺損邊緣可見少量纖維骨痂形成；8周后見邊緣有少量成骨細胞,纖維結(jié)締組織長滿空腔；12周時見有纖維肉芽組織形成,但缺損中

23、心區(qū)域未見成骨細胞形成。
　　 結(jié)論:
　　 1.骨髓間充質(zhì)干細胞在可注射nHA/CS材料上正常生長、增殖、分化,體外實驗表明該材料對細胞無毒性,具有良好的生物相容性。
　　 2.富集BMSCs-nHA/CS對兔股骨骨缺損修復(fù)效果較單純nHA/CS凝膠材料好,而后者又優(yōu)于空白組,單純nHA/CS材料組修復(fù)效果優(yōu)于空白組,說明nHA/CS材料參與了骨的修復(fù)；細胞支架復(fù)合體組的修復(fù)效果優(yōu)于支架組和空白組,說明體外擴增