B7-H4在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)及其在T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中作用的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌常見的類型，預(yù)后較差，治療易耐藥。免疫治療是近年來科學(xué)工作者廣泛認(rèn)同的較為理想的腫瘤治療方法，但免疫治療對NSCLC的療效甚微，其療效的提高有賴于對腫瘤局部免疫微環(huán)境的深入了解。B7-H4是共刺激分子，參與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控。大部分的人類腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)B7-H4。B7-H4與NSCLC的相關(guān)性研究，目前國內(nèi)外

2、研究主要集中在B7-H4表達(dá)與NSCLC的臨床病理及預(yù)后的相關(guān)性，而B7-H4表達(dá)對NSCLC的生物學(xué)行為和免疫反應(yīng)有何影響尚未見報(bào)道，其在細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路及調(diào)控機(jī)理尚待深入研究。我們的研究首先探討B(tài)7-H4在NSCLC組織中的表達(dá)及其與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步檢測人NSCLC細(xì)胞系中B7-H4基因mRNA的表達(dá)狀況及構(gòu)建B7-H4特異的RNA干擾(RNAi)質(zhì)粒載體，研究NSCLC B7-H4基因表達(dá)沉默對細(xì)胞增殖、侵襲、黏附和

3、細(xì)胞周期的影響，并與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)，探討B(tài)7-H4分子對免疫反應(yīng)中T淋巴細(xì)胞功能的影響。最后探討IFN-α和IFN-γ對A549細(xì)胞B7-H4mRNA和蛋白表達(dá)的影響。為今后進(jìn)一步研究B7-H4表達(dá)調(diào)控機(jī)理，進(jìn)而研究B7-H4在細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路，為腫瘤免疫干預(yù)提供新的思路。
　　 方法:
　　 1、收集102例NSCLC患者的癌組織標(biāo)本及臨床病例資料，免疫組織化學(xué)法檢測NSCLC組織中B7-H4蛋白的表達(dá)以及T

4、淋巴細(xì)胞亞群的浸潤，分析B7-H4的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征及T淋巴細(xì)胞浸潤的相關(guān)性。
　　 2、RT-PCR法檢測人NSCLC細(xì)胞株SPCA-1、GLC-82、A549中B7-H4基因mRNA的表達(dá)。
　　 3、將B7-H4短發(fā)夾狀RNA(short hairpin RNA，shRNA)序列克隆到質(zhì)粒pGCsi-U6/Neo載體，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建的B7-H4 shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，建

5、立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。RT-PCR、Western Blot檢測B7-H4基因表達(dá)沉默前后細(xì)胞的B7-H4表達(dá)變化，MTT實(shí)驗(yàn)以及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察B7-H4基因表達(dá)沉默對A549細(xì)胞增殖能力影響，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測B7-H4基因表達(dá)沉默對A549細(xì)胞的遷移能力影響，流式細(xì)胞儀檢測B7-H4基因表達(dá)沉默對A549細(xì)胞的細(xì)胞周期影響。
　　 4、將Jurkat細(xì)胞與B7-H4基因表達(dá)沉默的A549細(xì)胞共培養(yǎng)，MTT法檢測

6、B7-H4基因表達(dá)沉默對共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞抑制的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測B7-H4基因表達(dá)沉默對Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞周期影響，RT-PCR、Western Blot檢測B7-H4基因表達(dá)沉默對Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2及IL-10影響。
　　 5、用不同濃度(100、500、1000、2000U·ml-1)的IFN-α和IFN-γ分別處理A549細(xì)胞，RT-PCR、Western Blot檢測IFN-α和IFN-γ對

7、A549細(xì)胞的B7-H4表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、102例NSCLC組織中，B7-H4表達(dá)的陽性率為56.9％，B7-H4可表達(dá)于肺癌細(xì)胞的胞膜、胞漿內(nèi)或二者均有表達(dá)，陽性者表達(dá)強(qiáng)度大部分在(++)以上。不同年齡、性別、吸煙史或分化程度患者B7-H4陽性表達(dá)率間均無顯著性差異（P＞0.05）;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者B7-H4的陽性表達(dá)率間有顯著性差異（P＜0.05），B7-H4陽性TILs的數(shù)量

8、低于B7-H4陰性TILs的數(shù)量(P＜0.05）。
　　 2、B7-H4基因在人NSCLC細(xì)胞株SPCA-1、GLC-82、A549中呈陽性表達(dá)。
　　 3、成功構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體能有效地干擾A549細(xì)胞B7-H4mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。RT-PCR和Western Blot檢測顯示陽性轉(zhuǎn)染組B7-H4表達(dá)較空白對照組、空載質(zhì)粒組降低。MTT結(jié)果表明隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的逐漸延長，陽性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率遞增，較空白對

9、照組及空載質(zhì)粒組細(xì)胞存在顯著差異(P＜0.05)，而空白對照組和空載質(zhì)粒組間無顯著差異（P＞0.05）。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)染組的克隆形成數(shù)為158.3±9.452，明顯低于空白對照組（克隆形成率為243.3±12.34）(P＜0.05)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與空白對照組（遷移細(xì)胞數(shù)為128.32±10.50）以及空載質(zhì)粒組(遷移細(xì)胞數(shù)為119.35±4.73)相比，陽性轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)（87.67±9.07）

10、明顯減少(P＜0.05)。與空白對照組（穿過基底膜細(xì)胞數(shù)為39.72±3.50）以及空載質(zhì)粒組(穿過基底膜細(xì)胞數(shù)為37.01±1.74)相比，陽性轉(zhuǎn)染組的穿過基底膜細(xì)胞數(shù)（23.14±2.08）減少（P＜0.05）。空白對照組、空載質(zhì)粒組和陽性轉(zhuǎn)染組三組A549細(xì)胞株經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，陽性轉(zhuǎn)染組G0/G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量分別為35.51±4.11％和35.37±1.87％，空白對照組（G0/G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量分別為

11、31.22±3.34％和44.72±2.41％）及空載質(zhì)粒組（G0/G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量分別為30.42±2.45％和45.04±2.69％），提示陽性轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞呈G0/G1期阻滯，而G2/M期細(xì)胞數(shù)量分布減少，細(xì)胞增殖受抑。
　　 4、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著時(shí)間的延長，與陽性轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力明顯較與空白對照組及空載質(zhì)粒組共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞增高(P＜0.05)。細(xì)胞生長至48h，與

12、陽性轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞細(xì)胞增殖抑制率明顯超過與空載質(zhì)粒組和空白對照組共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞(P＜0.05)。而空白對照組和空載質(zhì)粒組間比較無顯著差異(P＞0.05)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示與陽性轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞為37.28±3.35％，明顯低于空白對照組（63.36±5.45％）以及空載質(zhì)粒組(66.05±6.02％)(P＜0.05);與陽性轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞的S+G2/M期細(xì)胞為6

13、2.76±5.56％，明顯高于空白對照組（36.65±3.28％）以及空載質(zhì)粒組(33.92±3.64％)(P＜0.05)。與陽性轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平為0.27±0.07％，明顯低于空白對照組（5.36±0.45％）以及空載質(zhì)粒組（6.14±0.36％）（P＜0.05），空白對照組和空載質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡水平無顯著差異（P＞0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示與陽性轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞的IL-10和IL-2mR

14、NA表達(dá)量分別為1.12±0.12和1.21±0.02，均明顯高于空白對照組（0.89±0.09和0.89±0.09）以及空載質(zhì)粒組(0.91±0.08和0.87±0.08)(P＜0.05);同時(shí)，Western Blot結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)染組組的IL-10和IL-2蛋白表達(dá)分別為1.98±0.02和1.46±0.02均明顯高于空白對照組(0.89±0.09和0.92±0.09)以及空載質(zhì)粒組(0.87±0.08和0.93±0.09)(P＜

15、0.05)。
　　 5、隨著IFN-α濃度的增加，A549細(xì)胞B7-H4mRNA表達(dá)增強(qiáng)，組間相比差異具有顯著差異(F=13.30，P＜0.05)。而隨著IFN-γ濃度的增加，A549細(xì)胞B7-H4mRNA表達(dá)變化組間相比差異無顯著性(F=16.54，P＞0.05)。隨著IFN-α濃度的增加，B7-H4蛋白表達(dá)增強(qiáng)，組間相比差異具有顯著性(F=18.69，P＜0.05)，而隨著IFN-γ濃度的增加，A549細(xì)胞B7-H4蛋白表達(dá)

16、變化不明顯，組間相比無明顯差異(F=17.46，P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、B7-H4在NSCLC組織中高表達(dá)，且B7-H4表達(dá)水平與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與肺癌組織CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤程度呈負(fù)相關(guān)，B7-H4可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　 2、SPCA-1、GLC-82、A549細(xì)胞表達(dá)B7-H4基因。
　　 3、成功構(gòu)建靶向B7-H4基因的shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染

17、A549細(xì)胞，能有效抑制細(xì)胞的B7-H4mRNA和蛋白表達(dá)。抑制B7-H4基因可抑制A549細(xì)胞的增殖，抑制A549細(xì)胞的遷移能力，降低A549細(xì)胞的侵襲能力，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，抑制B7-H4基因可使A549細(xì)胞G0/G1期阻滯，而G2/M期細(xì)胞數(shù)量分布減少，細(xì)胞增殖受抑制。
　　 4、B7-H4基因表達(dá)沉默能夠有效增加T淋巴細(xì)胞的增殖能力。B7-H4基因表達(dá)沉默可以減少T淋巴細(xì)胞細(xì)胞凋亡，有效上調(diào)T淋巴細(xì)胞的IL-10