腦血管痙攣中縫隙連接蛋白Cx43、Cx40磷酸化水平及其磷酸化位點(diǎn)分析.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
   心腦血管系統(tǒng)中主要表達(dá)和起作用的縫隙連接蛋白為Cx43和Cx40,其磷酸化在許多心腦血管疾病中扮演著重要角色。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上,分析腦血管痙攣中縫隙連接蛋白Cx43、Cx40的磷酸化水平并利用質(zhì)譜技術(shù)篩選出其磷酸化位點(diǎn)。為更深入研究縫隙連接蛋白Cx43、Cx40磷酸化參與蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后腦血管痙攣(CVS)的機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),并為下一步篩選出對(duì)CVS有效藥物提供靶點(diǎn)。
   方法:

2、>   1、ET-1誘導(dǎo)的SD大鼠腦基底動(dòng)脈血管條CVS模型的建立:采用同種系SD大鼠,麻醉后斷頭取腦,顯微鏡下分離腦基底動(dòng)脈,將其剪成完整的動(dòng)脈條,400pmolET-1孵育動(dòng)脈條,建成ET-1誘導(dǎo)的SD大鼠腦基底動(dòng)脈血管條CVS模型。
   2、CVS模型的檢測(cè):分為ET-1刺激組和正常組,比對(duì)ET-1刺激后血管條發(fā)生的張力變化。
   3、CVS組和正常組中Cx43、Cx40磷酸化水平的分析:利用磷酸化蛋白富集試

3、劑盒富集CVS組和正常組中的磷酸化總蛋白,再利用Western Blotting技術(shù)分析CVS組和正常組中Cx43、Cx40磷酸化水平的改變。
   4、CVS中Cx43、Cx40磷酸化位點(diǎn)的檢測(cè):利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)CVS中Cx43、Cx40磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析,篩選出CVS中Cx43、Cx40發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)。
   結(jié)果:
   1、成功建立ET-1誘導(dǎo)的SD大鼠腦基底動(dòng)脈血管條CVS模型,血管條張力檢測(cè)發(fā)現(xiàn),

4、ET-1刺激后血管條張力發(fā)生明顯的改變。
   2、正常腦基底動(dòng)脈中Cx43、Cx40都處于相對(duì)較低的磷酸化水平,但與Cx43相比,Cx40處于相對(duì)較高的的磷酸化水平。
   3、CVS后Cx43、Cx40磷酸化水平明顯升高,然而比較Cx43、Cx40磷酸化蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)CVS中磷酸化GJ蛋白的表達(dá)主要以Cx40為主。
   4、前期我們研究表明正常腦基底動(dòng)脈平滑肌層的GJ蛋白主要為Cx40,CVS后則以Cx43

5、的表達(dá)為主,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn):CVS后腦基底動(dòng)脈平滑肌中總蛋白的表達(dá)主要為Cx43,而磷酸化蛋白的表達(dá)則以Cx40為主。
   5、對(duì)CVS中Cx43與Cx40進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)檢測(cè),分別篩選出Cx40的9個(gè)磷酸化位點(diǎn)和Cx43的4個(gè)磷酸化位點(diǎn)。
   結(jié)論:
   CVS后這種總蛋白與磷酸化蛋白表達(dá)的不一致可能在CVS的病理過(guò)程中起到重要作用。并且篩選出來(lái)的Cx40的9個(gè)磷酸化位點(diǎn)和Cx43的4個(gè)磷酸化位點(diǎn)可

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