桿狀病毒AcMNPV orf—51基因功能研究.pdf

1、AcMNPVorf-51基因是1994年MarinD等對(duì)AcMNPV基因組全序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)的156個(gè)ORF中的一個(gè)。該基因由957個(gè)核苷酸組成，編碼含318個(gè)氨基酸殘基的大小為37KDa的蛋白質(zhì)，多年以來(lái)，未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道其功能。 以O(shè)RF-51蛋白的氨基酸序列對(duì)GenBankBLAST結(jié)果表明，ORF-51蛋白內(nèi)部有一個(gè)保守的RNA結(jié)合motif,預(yù)測(cè)其為RNA結(jié)合蛋白，主要與RNA的轉(zhuǎn)錄、修飾相關(guān)，但功能還有待試驗(yàn)證實(shí)。

2、 本論文綜合利用Bac-to-Bac和ET-Recombination的策略，通過(guò)基因敲除等方法研究orf-51基因在桿狀病毒中的生物學(xué)功能。首先，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增orf-51基因的上下游序列，再經(jīng)過(guò)克隆將抗性基因連入orf-51基因的上下游序列之間構(gòu)成敲除orf-51基因的線形DNA同源片段。隨后將此線形DNA同源片段電轉(zhuǎn)入含AcBacmid-PG的E.coli菌株，通過(guò)ET-Recombination技術(shù)發(fā)生同源重組，最后在含

3、ZeocinTM的低鹽LB平板上篩選orf-51缺失Zeocin插入的重組BacmidpAcKO。提取pAcKODNA，將其轉(zhuǎn)染sf-9昆蟲(chóng)細(xì)胞，以研究orf-51的缺失對(duì)AcMNPV復(fù)制的影響。用可在熒光顯微鏡下觀察的gfp基因及可在光學(xué)顯微鏡下觀察的polyhedrin基因作為雙標(biāo)記基因，GFP用以指示BV的產(chǎn)生及在離體細(xì)胞中的傳播，POLH則用來(lái)指示重組病毒在離體細(xì)胞中感染的進(jìn)程。因此，構(gòu)建了兩個(gè)帶雙標(biāo)記基因的重組Bacmid：o

4、rf-51敲除型pAcKO-GP和orf-51野生型pAcwt-GP。將pAcKO-GP和pAcwt-GP的病毒DNA分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，由GFP的傳播狀態(tài)可直接觀察這兩種重組病毒在復(fù)制能力方面有無(wú)差別。試驗(yàn)結(jié)果表明，pAcKo-Gp和pAcWt-GP均能產(chǎn)生BV和形成多角體，轉(zhuǎn)染上清的感染試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，orf-51的缺失對(duì)病毒產(chǎn)生BV的能力沒(méi)有影響。在光學(xué)顯微鏡下觀察到orf-51的缺失對(duì)病毒ODV的產(chǎn)生沒(méi)有影響。生物學(xué)測(cè)定結(jié)果顯示