桿狀病毒保守基因AcMNPV ac54的研究.pdf

1、苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是桿狀病毒的代表種，AcMNPV ac54基因是桿狀病毒基因組中高度保守的核心基因之一。
　　 ac54位于AcMNPV病毒基因組的nt 45,222～nt 46,319，全長1098 bp，編碼365個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)編碼蛋白的分子量為42.094 kDa。在ac54基因上游沒有發(fā)現(xiàn)典型

2、的桿狀病毒早期啟動子CAGT，但其翻譯起始位點(diǎn)上游525 bp、545 bp和555 bp處分別存在3個(gè)典型的桿狀病毒晚期啟動子模序TAAG；在終止子TAG下游572 bp處存在一個(gè)典型的polyA加尾信號AATAAA。氨基酸序列比對分析表明，Ac54的氨基酸序列在桿狀病毒中具有非常高的保守性，與BmNPV、P1xyMNPV、RoMNPV的同源蛋白的相似性超過了95％。
　　 為了研究ac54的生物學(xué)功能，通過ET同源重組技術(shù)，

3、首次成功地從含有AcMNPV全基因組的人工細(xì)菌染色體bMON14272中敲除了ac54基因。然后，通過Bac-to-Bac系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座方法，將ac54插入到缺失ac54基因的重組病毒多角體蛋白基因(polh)位點(diǎn)中，構(gòu)建出異位補(bǔ)回ac54基因的重組病毒。為了便于觀察不同重組病毒對宿主細(xì)胞的侵染進(jìn)程，又分別構(gòu)建了帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(egfp)和polh雙標(biāo)記的ac54缺失型重組病毒、ac54補(bǔ)回型重組病毒和野生型病毒。
　　

4、 分別將ac54缺失型重組病毒、ac54補(bǔ)回型重組病毒和野生型病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ac54缺失型重組病毒侵染細(xì)胞后不能產(chǎn)生有感染性的子代病毒，而ac54補(bǔ)回型重組病毒和野生型病毒均能產(chǎn)生有感染性的子代病毒。病毒生長曲線測定結(jié)果表明，ac54補(bǔ)回型重組病毒和野生型病毒產(chǎn)生感染性病毒的能力相當(dāng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，ac54的缺失不影響病毒DNA的復(fù)制。通過對病毒侵染細(xì)胞的超薄切片進(jìn)行電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ac54補(bǔ)回型重組病毒侵染

5、細(xì)胞后的病理變化同野生型完全一致；但在被ac54缺失型病毒侵染的細(xì)胞中，雖然可以在細(xì)胞核內(nèi)觀察到正常的病毒發(fā)生基質(zhì)結(jié)構(gòu)(virogenic stroma，VS)，但在VS中卻沒有病毒核衣殼，反而出現(xiàn)許多圓或橢圓形、高電子密度的致密小體結(jié)構(gòu)；同時(shí)，在細(xì)胞核以內(nèi)VS以外的環(huán)帶區(qū)域(ring zone，RZ)堆積了大量的囊泡結(jié)構(gòu)和空心管狀結(jié)構(gòu)。相比起正常核衣殼250 nm～400 nm的長度，這些空心管狀結(jié)構(gòu)長達(dá)數(shù)微米。以VP39抗體為一抗進(jìn)

6、行免疫電鏡實(shí)驗(yàn)后證實(shí)，這些空心管狀結(jié)構(gòu)就是病毒核衣殼空管。
　　 為了進(jìn)一步探究ac54缺失型病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，于細(xì)胞核內(nèi)VS出現(xiàn)的新型致密小體結(jié)構(gòu)以及堆積于RZ區(qū)域的超長核衣殼空管結(jié)構(gòu)的組成成分，我們利用多種病毒核衣殼必需結(jié)構(gòu)蛋白的抗體為一抗，進(jìn)行了一系列免疫電鏡實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P6.9蛋白特異性定位于該高電子密度致密小體；核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白BV/ODV-C42和38K并不存在于衣殼樣結(jié)構(gòu)上，而是分布在靠近衣殼的囊泡結(jié)構(gòu)周圍；P