桿狀病毒AcMNPV p48基因的研究.pdf

1、桿狀病毒主要被用作生物農(nóng)藥來控制農(nóng)、林業(yè)害蟲，此外，還被廣泛地用作外源基因表達載體，在昆蟲細胞中表達大量目的蛋白，同時可作為基因轉(zhuǎn)移載體用于基因治療。到目前為止，已有45株桿狀病毒的全基因組序列被測定，在這些已經(jīng)測定全基因組序列的桿狀病毒中，除了雙翅目昆蟲桿狀病毒--庫蚊核多角體病毒(Culexnigripalpusnucleopolyhedrovirus，CuniNPV)外，p48(ac103)基因在其余的昆蟲桿狀病毒中都存在，說明該

2、基因在桿狀病毒系統(tǒng)演化過程中極為保守，暗示其具有重要的生物學(xué)功能，但是它的功能并未被揭示。本研究以桿狀病毒代表種--苜蓿γ紋夜蛾多粒包埋型核多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV)為研究對象，綜合利用Bac-to-Bac系統(tǒng)和ET同源重組的策略，構(gòu)建了缺失p48基因的重組病毒，探討了p48基因的缺失對病毒復(fù)制的影響，并研究了P48在病毒粒子中的定位，在

3、病毒感染細胞中的表達時相及亞細胞定位。 序列分析發(fā)現(xiàn)，AcMNPVp48基因位于AcMNPV基因組88,375nt～89,538nt之間，該基因全長1164bp，編碼387個氨基酸，預(yù)計編碼蛋白的分子量為45.182kDa。在P48蛋白的aa163～179處可能存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域，預(yù)測該蛋白在膜上的方向可能是N-端朝外。InterProScan分析結(jié)果表明AcMNPV的P48蛋白及其同源蛋白構(gòu)成桿狀病毒P48蛋白家族且功能未知。

4、 利用Bac-to-Bac系統(tǒng)和ET同源重組的策略，在大腸桿菌DH10B細胞中成功將AcMNPVBacmid基因組中304-bpp48基因片段替換為氯霉素基因Cm，獲得缺失型重組病毒。為了更直接地觀察p48基因的敲除可能對病毒侵染所產(chǎn)生的影響，將綠色熒光蛋白基因gfp和多角體基因polh作為標(biāo)記基因，通過轉(zhuǎn)座作用插入p48缺失型重組病毒的polh位點，獲得帶雙標(biāo)記的缺失型重組病毒。為了證實p48基因的缺失沒有影響到其他基因，同樣

5、通過轉(zhuǎn)座作用將其自身啟動子控制下的p48基因以及gfp和polh這2個標(biāo)記基因同時插入到p48缺失型重組病毒的polh位點，獲得補回型重組病毒。利用相同的方式獲得帶有雙標(biāo)記的野生型對照病毒。將這三種帶雙標(biāo)記的重組Bacmid分別轉(zhuǎn)染Sf9細胞，顯微觀察和病毒生長曲線測定結(jié)果表明，p48基因缺失型重組病毒不能產(chǎn)生有感染性的芽生型病毒粒子(Buddedvirus，BV)，而p48基因補回型重組病毒產(chǎn)生感染性病毒粒子的能力與野生型病毒無異。為

6、了確定在p48基因缺失型重組病毒中是否產(chǎn)生BV，用核衣殼蛋白VP39的抗體對分離純化的BV進行Westernblot分析，結(jié)果證實p48基因的缺失導(dǎo)致病毒不能產(chǎn)生BV。而實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，p48基因的缺失不影響病毒DNA的復(fù)制。 為了進一步研究p48基因的缺失是否對病毒粒子的形態(tài)發(fā)生產(chǎn)生影響，我們分別用p48基因缺失型、補回型和野生型重組BacmidDNA轉(zhuǎn)染的細胞制作了超薄切片，進行電子顯微鏡觀察。在補回型病毒D

7、NA轉(zhuǎn)染的細胞中，觀察到的現(xiàn)象與野生型病毒DNA轉(zhuǎn)染的細胞一致。但是，在p48缺失型重組BacmidDNA轉(zhuǎn)染的細胞中，在轉(zhuǎn)染后24h，在細胞核中央可以觀察到結(jié)構(gòu)精密的病毒發(fā)生基質(zhì)，以及形態(tài)與野生型無異的正常的核衣殼，但是，在細胞質(zhì)中沒有觀察到核衣殼，也沒有觀察到核衣殼正在通過細胞質(zhì)膜形成BV；在病毒感染晚期，成束的核衣殼聚集在環(huán)帶區(qū)域等待裝配，但是觀察不到作為包埋型病毒(Occlusion-derivedvirus，ODV)囊膜前體的

8、微囊泡，也沒有觀察到核衣殼被包裹形成ODV，最終雖然觀察到形態(tài)、大小正常的多角體，但是多角體中沒有包埋病毒粒子。這些實驗結(jié)果表明，p48基因的缺失不僅影響了BV的形成，并且影響了ODV的形成，并導(dǎo)致多角體中最終沒有包埋ODV。 鑒于p48基因的缺失對病毒粒子形態(tài)發(fā)生的影響，為了確定P48蛋白是否病毒粒子的結(jié)構(gòu)成分，分別構(gòu)建了在P48蛋白C-端和N-端融合HA-tag的補回型重組病毒，利用融合蛋白上所帶標(biāo)簽的抗體進行定位研究。對帶

9、有HA-tag的補回型重組病毒進行了P48蛋白在Sf9細胞中的表達時相分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在C-端融合HA-tag的重組病毒感染的Sf9細胞中，在病毒感染后12h即可檢測到一條43kDa左右的蛋白條帶能與HA抗體發(fā)生特異性結(jié)合，該特異性蛋白的表達一直持續(xù)到感染后96h；而在N-端融合HA-tag的重組病毒感染的Sf9細胞中，一直到感染后96h都沒有檢測到與HA抗體特異結(jié)合的蛋白。 用C-端融合HA-tag的補回型重組病毒感染Sf9細胞

10、，純化病毒粒子BV和ODV，并進一步分別從純化的BV和ODV中分離出囊膜和核衣殼，然后利用融合蛋白上帶有HA-tag的抗體對分離純化的BV和ODV，以及進一步分離出的囊膜和核衣殼組分進行蛋白免疫印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BV和ODV的囊膜和核衣殼上都能檢測到P48蛋白，大小與細胞樣品中的一致。蛋白免疫印跡的結(jié)果表明，AcMNPVP48蛋白可能同時是BV和ODV的囊膜和核衣殼的結(jié)構(gòu)組分。 為了研究P48蛋白在病毒侵染細胞過程中的亞細胞定

11、位情況，我們構(gòu)建了能融合表達帶有自身啟動子的p48基因與gfp基因的重組病毒，并以p48基因啟動子啟動下單獨表達gfp基因的病毒為對照。用構(gòu)建的重組Bacmid轉(zhuǎn)染的Sf9細胞進行激光共聚焦實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在整個感染過程中，融合蛋白在整個細胞中均有分布，但是從病毒感染后16h到72h，融合蛋白較為集中在病毒發(fā)生基質(zhì)處，并且在病毒感染后16至24h，在疑似環(huán)帶區(qū)域處有較為集中的分布。 綜合以上實驗結(jié)果，表明AcMNPVp48基因是病