慢性乙型肝炎病毒感染合并非酒精性脂肪性肝病動(dòng)物模型的建立和機(jī)制研究.pdf

1、目的：1)采用高脂飲食(HFD)喂飼乙型肝炎病毒(hepatitis B vires,HBV)轉(zhuǎn)基因小鼠,建立慢性HBV感染合并非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的動(dòng)物模型,并采用生化、分子生物學(xué)及組織病理學(xué)指標(biāo)加以鑒定。2)探索HBV轉(zhuǎn)基因小鼠造模時(shí)間,揭示慢性HBV感染對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)下NAFLD發(fā)生、病程及轉(zhuǎn)歸的影響及機(jī)制;同時(shí)研究TLRs/MyD88信號(hào)途徑與肝內(nèi)炎癥

2、的關(guān)系,以及IL-6等促炎細(xì)胞因子水平變化對(duì)肝臟炎癥反應(yīng)的影響。3)探討TLRs/MyD88信號(hào)途徑及IL-6等促炎細(xì)胞因子在HBV轉(zhuǎn)染合并肝細(xì)胞株脂肪變模型中的作用。
　　方法：1)將攜帶HBV全基因組的小鼠隨機(jī)分為雄性對(duì)照組、雄性NAFLD模型組、雌性對(duì)照組、雌性NAFLD模型組。各模型組給予高脂飲食(含膽固醇2％、豬油10％、基礎(chǔ)飼料88％),對(duì)照組則喂飼基礎(chǔ)飼料。分批于第8、16、24周末處死,檢測體質(zhì)指數(shù)、肝腎功能、糖脂

3、代謝等NAFLD相關(guān)指標(biāo)二血清HBV分型、HBeAg、HBV-DNA,以及肝組織HBsAg免疫組化染色等病毒學(xué)指標(biāo);并通過HE、Mason及油紅O染色評(píng)價(jià)肝臟組織病理學(xué)的改變。2)檢測各組小鼠肝組織中TLR4,MyD88和IL-6 tuRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平,分析其變化與肝臟免疫學(xué)指標(biāo)、IR標(biāo)志物以及肝臟病理學(xué)改變之間的相關(guān)性。3)建立細(xì)胞模型,以不同濃度硬脂酸作為脂肪變性的誘導(dǎo)劑,觀察HepG2.2.15細(xì)胞脂變的情況。檢測HBV-D

4、NA表達(dá)水平和TLR4,MyD88和IL-6 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1)與對(duì)照組相比,不同造模時(shí)間的雌性和雄性NAFLD模型組小鼠體重、肝重、肝指數(shù)均顯著增高;ALT、AST、ALP、γ-GT、總膽紅素(TBIL)、膽汁酸(TBA)等肝功能指標(biāo)受損:總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FBG)等糖脂代謝指標(biāo)也有不同程度升高。各模型組小鼠的血清HB

5、V-DNA、HBeAg水平呈下降趨勢,肝細(xì)胞HBsAg陽性率無明顯差異。組織病理學(xué)檢查提示,造模第8周時(shí)雌、雄模型組小鼠均可見不同程度的肝細(xì)胞脂肪變,伴小葉內(nèi)散在的點(diǎn)狀壞死及炎癥細(xì)胞浸潤;第24周時(shí)肝臟脂肪變及炎癥雖未明顯加重,但有竇周纖維化和中央靜脈周圍纖維化。2)血清HBV-DNA和HBeAg,HBsAg的檢測顯示,肝細(xì)胞脂肪變乃至NAFLD的發(fā)生都不增加HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清及肝臟的病毒學(xué)指標(biāo)。雌性NAFLD模型組炎癥、壞死、纖維化

6、等肝組織病理學(xué)變化較輕,NAS評(píng)分在8、16、24等各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于相應(yīng)的雄性NAFLD模型組。3)TLR-4/MyD88途徑及其下游產(chǎn)物在高脂飲食的HBV感染的小鼠中表達(dá)增高。TLR-4和MyD88在mRNA水平隨著肝脂肪變性的嚴(yán)重程度而顯著上調(diào)。免疫組化結(jié)果顯示,NAFLLD+HBV組的TLR-4和MyD88的染色強(qiáng)度明顯高于HBV對(duì)照組和正常對(duì)照組。在NAFLLD+HBV組中的IL-6的活性也明顯高于對(duì)照組。4)HepG2.2.

7、15細(xì)胞脂肪變性模型顯示,硬脂酸處理組和正常對(duì)照的HBV-DNA水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí),經(jīng)過硬脂酸刺激的HepG2.2.15細(xì)胞在48小時(shí)后TLR-4和MyD88的表達(dá)量明顯增加。TLR-4/MyD88的下游產(chǎn)物IL-6的表達(dá)在硬脂酸處理組有明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：成功建立慢性HBV感染合并NAFLD動(dòng)物模型,為進(jìn)一步研究慢性乙型肝炎合并NAFLD發(fā)病機(jī)制、藥物篩選及療效評(píng)價(jià)等提供了可靠的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。雌激素可能在雌性NAFLD模型組