非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立及其免疫學損傷機制的研究.pdf

1、背景及目的:
　　非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，包括單純性脂肪肝（simple steatosis），非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH），以及NASH相關的肝纖維化/肝硬化、肝癌。隨著生活水平的提高，NAFLD在發(fā)展中國家的發(fā)病率顯著上升，我國NAFLD患者數(shù)量在過去的10年增加了

2、近一倍，部分地區(qū)的發(fā)病率已達四分之一。同時，我國是病毒性肝炎感染的高發(fā)地區(qū)，約有1億HBV感染者及4000萬HCV感染者，其中合并NAFLD的患者有逐年增加的趨勢，這一部分人群已經(jīng)引起了研究者們的注意。
　　目前關于NAFLD合并病毒性肝炎的研究多集中在NAFLD合并慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C,CHC)：NAFLD可以增加CHC患者進展為肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcino

3、ma,HCC)的風險，并降低抗病毒治療的療效。但是，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)本身具有致肝細胞脂肪變的作用，因此在NAFLD合并CHC患者中得到的結(jié)論可能并不能推而廣之。關于NAFLD對慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的影響，目前的研究結(jié)果卻并不一致，與CHC中看到的現(xiàn)象也不相同。部分研究認為，肝臟脂肪變對CHB具有保護作用：在脂肪肝患者中，乙型肝炎病毒(Hepatitis

4、B virus,HBV)載量更低，乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)清除率更高。但另一方面，一些研究顯示，脂肪肝可能會增加CHB患者發(fā)展為肝硬化及HCC的風險，降低恩替卡韋抗病毒治療的效果。還有一些研究認為，脂肪肝對HBV病毒載量及干擾素抗病毒治療無影響。事實上，這方面的研究存在許多難點，可能是導致這些矛盾結(jié)論的原因。首先，研究中多用肝臟超聲診斷脂肪肝。肝臟超聲檢查僅能檢出肝內(nèi)脂肪沉積

5、超過30％的中度脂肪肝，難以檢出輕度脂肪肝（肝臟內(nèi)脂肪沉積為5％-30％），因此在分組時，可能將輕度脂肪肝患者作為無脂肪肝的對照。其次，在研究NAFLD合并CHB時，難以保證受試者在代謝、病毒、治療等多種因素上的一致性。第三，人群研究難以獲取肝組織觀察肝內(nèi)免疫、代謝等方面的改變。因此，NAFLD在慢性病毒性肝炎中的影響仍不明確。
　　動物模型可以克服上述臨床研究中的不足，但目前尚缺乏NAFLD合并病毒性肝炎的動物模型。為了更好的研

6、究NAFLD對慢性病毒性肝炎的影響，本研究的具體研究目標如下：
　　1.成功建立飲食誘導的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型；
　　2.在飲食誘導的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型中，動態(tài)觀察肝炎病毒的復制情況及肝組織損傷程度；
　　3.探討NAFLD影響病毒性肝炎病程的相關免疫學機制。
　　方法:
　　1.采用60％高脂飲食（High fatty diet,HFD）喂養(yǎng)C3H/HeN小鼠12周，觀察小鼠一般

7、狀態(tài)及生活習性改變，觀察體重、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL)、血糖（Glucos

8、e,GLU）、胰島素水平及穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance,HOMA-IR）的動態(tài)變化及肝臟組織學變化。
　　2.3型鼠肝炎病毒（Murine hepatitis virus-3,MHV-3）腹腔注射感染NAFLD小鼠，觀察小鼠一般狀態(tài)及生存率；動態(tài)觀察小鼠感染后血清生化學變化及肝臟病理改變；逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應（Reverse transcr

9、iption-polymerase chain reaction,RT-PCR）檢測小鼠肝內(nèi)MHV-3。
　　3. MHV-3腹腔感染NAFLD小鼠及正常飲食（Normal diet, ND）小鼠，比較兩組小鼠生存率；比較兩組小鼠各時間點血清生化學變化及肝組織病理改變；實時定量聚合酶鏈反應(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)檢測并比較各時間點兩組小鼠肝內(nèi)MHV-3復

10、制情況。
　　4.流式細胞術檢測MHV-3感染后各時間點小鼠肝內(nèi)CD3+CD8+CD69+T細胞、CD3+CD8+PD-1+T細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例的變化，并比較兩組小鼠之間的差異；Real-time PCR檢測并比較兩組小鼠MHV-3感染后各時間點肝內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-33、TNF-α、Fgl2的表達，并比較兩組小鼠之間的差異。
　　結(jié)果:

11、>　　1.成功建立NAFLD小鼠模型。HFD飲食喂養(yǎng)12周，C3H/HeN小鼠體型肥胖，皮毛油膩，不喜活動，體重明顯增加；外周血ALT及AST水平無顯著升高；TG、TC、HDL、LDL、GLU、胰島素水平及HOMA-IR均顯著升高；小鼠肝臟體積增大，肝重高于ND組，邊緣圓鈍，色澤紅黃，表面光滑，有油膩感；肝組織切片HE染色及油紅O染色可見肝細胞內(nèi)大量脂滴形成。
　　2.成功建立飲食誘導的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。NAFLD

12、小鼠感染MHV-3病毒后，在3-12天內(nèi)出現(xiàn)死亡，死亡率約為20％；感染小鼠外周血ALT和AST水平顯著升高；感染小鼠肝臟蒼白，缺乏光澤，并可見彌漫分布的針尖樣出血點；HE染色除可見肝細胞內(nèi)脂滴形成，還可見肝細胞胞漿疏松、肝細胞壞死、淋巴細胞浸潤等表現(xiàn)；PCR可檢測到肝內(nèi)MHV-3病毒復制。
　　3.NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后，生存率與對照組無差異；MHV-3病毒復制高于對照組，于感染4天時有統(tǒng)計學差異（P=0.002）；

13、ALT及AST升高幅度大于ND組；肝組織炎癥壞死程度交對照組嚴重。
　　4.NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后，肝內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-33、TNF-α、Fgl2表達水平上調(diào)，且上調(diào)幅度大于ND組小鼠，而IL-22表達水平降低，且降低幅度大于對照組小鼠。
　　5.NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后，肝內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例降低，但感染第16天開始高于ND組小鼠；CD

14、3+CD8+CD69+T及CD3+CD8+PD1+T細胞均出現(xiàn)升高，上升幅度大于ND組小鼠，且細胞比例回落后仍持續(xù)高于ND組小鼠。
　　結(jié)論:
　　1.本研究采用HFD喂養(yǎng)C3H/HeN小鼠12周成功建立NAFLD小鼠模型，并在此基礎上采用MHV-3病毒腹腔感染小鼠，成功建立NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。為研究NAFLD對病毒性肝炎的影響提供了動物模型，開辟了新的研究途徑。
　　2.NAFLD可以加劇肝內(nèi)MHV-3