降鈣素基因相關(guān)肽在創(chuàng)傷性腦損傷加速骨折愈合中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的患者如果合并有骨折，其愈合速度往往快于單純骨折，這一加速現(xiàn)象在臨床上十分常見(jiàn)，但機(jī)制至今未明。前人的研究多只限于單純的骨折局部、骨細(xì)胞層面，或者是只針對(duì)少數(shù)因子的單一研究，很少有學(xué)者將受損腦組織、血循環(huán)、骨折局部三個(gè)系統(tǒng)與單一神經(jīng)因子有序的聯(lián)系起來(lái)。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）作為廣泛分布于骨骺、骨

2、膜等骨組織中的神經(jīng)肽，在腦損傷后，顱腦內(nèi)的分泌明顯增加，最近研究還發(fā)現(xiàn)CGRP具有較強(qiáng)的促進(jìn)成骨能力。本課題組認(rèn)為T(mén)BI與骨折愈合加快具有相關(guān)性，而CGRP可能在TBI加速骨折愈合中起著關(guān)鍵的作用，本課題得到了國(guó)家自然科學(xué)基金的資助（30872634）。我們前期的研究建立了標(biāo)準(zhǔn)的股骨中段閉合骨折模型（F組）和重復(fù)性好的腦損傷模型（TBI組），首次應(yīng)用顯微CT的骨分析方法對(duì)比TBI+F組和F組的骨礦物質(zhì)含量（BMC）和骨礦物質(zhì)密度（BMD

3、），證實(shí)了SD大鼠在骨折合并腦外傷的情況下（TBI+F組）骨折愈合速度快于單純骨折（F組）。為進(jìn)一步探索TBI可以加速骨折愈合這一現(xiàn)象，前期研究又通過(guò)組織學(xué)觀察比較受損腦組織和骨折局部肌肉組織中CGRP的表達(dá)變化，結(jié)果顯示TBI+F組大鼠腦的脈絡(luò)叢有明顯的CGRP陽(yáng)性染色，而F組大鼠腦脈絡(luò)叢則沒(méi)有出現(xiàn)這種陽(yáng)性染色；TBI+F組骨折局部肌肉組織中CGRP的含量較F組升高，由此我們驗(yàn)證了TBI后血清中升高的CGRP與骨折愈合的加速具有正相關(guān)

4、性。為進(jìn)一步驗(yàn)證此相關(guān)性并闡明其作用機(jī)制，本課題組深入研究腦脊液中CGRP含量和骨折端CGRP受體表達(dá)的變化，并通過(guò)添加外源性的CGRP來(lái)觀察其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及破骨細(xì)胞的影響，深入探索CGRP在TBI加速骨折愈合中的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)一降鈣素基因相關(guān)肽及其受體在腦損傷合并骨折愈合中的表達(dá)變化
　　目的：通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)的同一個(gè)體的股骨閉合骨折模型及創(chuàng)傷性腦損傷模型，檢測(cè)血清和腦脊液中CGRP含量的改變，以及骨折端CGRP受

5、體表達(dá)的變化。
　　方法：制作Sprague-Dawley大鼠標(biāo)準(zhǔn)股骨中段閉合骨折模型，其中部分大鼠接受TBI，在術(shù)后，一周內(nèi)按照預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)處死大鼠取材股骨骨折端及抽取血清、腦脊液。取材不通時(shí)間點(diǎn)血清、腦脊液、及骨折端骨組織分別行ELISA、qRT-PCR檢測(cè)CGRP及其受體水平變化。
　　結(jié)果：ELISA檢測(cè)表明TBI合并骨折組血清中CGRP明顯升高（P<0.05）、腦脊液中CGRP明顯升高（P<0.05）；qRT-P

6、CR檢測(cè)表明TBI合并骨折組的骨折端骨組織中CGRP受體表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：上述結(jié)果證明TBI后骨折愈合加強(qiáng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明這種愈合加速的機(jī)制和受損傷腦組織釋放入血的高水平CGRP有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)二外源性降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及破骨細(xì)胞的影響研究
　　目的：觀察外源性CGRP對(duì)SD大鼠骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）增殖和成骨分化功能以及破骨細(xì)胞增殖的影響，以進(jìn)一

7、步證明CGRP在腦損傷合并骨折愈合中起到關(guān)鍵的作用。
　　方法：采用貼壁法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，擴(kuò)增傳代至第三代，根據(jù)分組，培養(yǎng)體系中添加含不同濃度（10-11～10-6mol/L）CGRP的條件培養(yǎng)液，WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；堿性磷酸酶染色、定量檢測(cè)及鈣結(jié)節(jié)染色法觀察CGRP誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化、礦化的效果。培養(yǎng)破骨細(xì)胞，在培養(yǎng)基中添加CGRP，經(jīng)過(guò)TRAP染色，與普通培養(yǎng)基組的破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況作對(duì)比。

8、>　　結(jié)果：BMSCs增殖率測(cè)定以及堿性磷酸酶定量測(cè)定結(jié)果顯示不同濃度的CGRP實(shí)驗(yàn)組均較空白對(duì)照組增加，且與所加的CGRP濃度呈劑量依賴關(guān)系，CGRP濃度大于1×10-10mol/L時(shí)差異有顯著性（P＜0.05）；堿性磷酸酶染色與鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果顯示，CGRP組均有陽(yáng)性顯色，對(duì)照組無(wú)顯色或顯色不明顯。
　　結(jié)論：CGRP能夠直接促進(jìn)體外培養(yǎng)的BMSCs增殖，并可短期內(nèi)誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，而且能有效抑制破骨細(xì)胞的生成。CGRP可在

9、骨修復(fù)及骨重建中發(fā)揮重要的作用。
　　實(shí)驗(yàn)三外源性降鈣素基因相關(guān)肽促進(jìn)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的作用機(jī)制研究
　　目的：觀察外源性CGRP對(duì)體外培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs成骨分化過(guò)程中細(xì)胞因子表達(dá)的影響，以探討CGRP促進(jìn)其成骨的作用機(jī)制。
　　方法：采用qRT-PCR方法檢測(cè)BMP-2、RunX2、堿性磷酸酶（ALP）、I型膠原(COLL-I)、骨粘連蛋白（Osteonectin，ON）等成骨相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的