長鏈非編碼RNA GAPLINC在結(jié)直腸癌中的表達及功能研究.pdf

1、研究背景及意義
　　結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是指由于基因、飲食和環(huán)境等多種致病因素的綜合作用下，結(jié)直腸粘膜的上皮組織轉(zhuǎn)化而成的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率分別位于全球惡性腫瘤的第三和第四位。在發(fā)達國家，其發(fā)病率更是位居惡性腫瘤的第二位。當結(jié)直腸癌病變局限于腸壁時，通過外科手術切除病灶，約70％-80％的病人能夠治愈，其5年生存率約為90％;但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率則銳減到60％。目前由于結(jié)直腸癌的早

2、期診斷依舊困難，相當一部分患者就診時就已經(jīng)有轉(zhuǎn)移了，所以結(jié)直腸癌的早期診斷及治療具有非常重要的臨床意義。
　　腫瘤的形成和進展是一個相當復雜的過程，涉及多個作用因素，基因突變和異常表達對腫瘤的形成和進展發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能。由于對結(jié)直腸癌形成有關癌基因、抑癌基因及作用機制等研究的進展，人們越來越意識到非編碼RNA、DNA的甲基化作用、組蛋白修飾以及染色質(zhì)位置和結(jié)構(gòu)變化對結(jié)直腸癌的形成及進展發(fā)揮非常重要的作用。長鏈非編碼RNA(long

3、 non-coding RNAs，lncRNAs)是長度為200-100，000堿基對的非編碼RNA分子，在早期研究中，lncRNAs一直被科學家認為是一些沒有意義的轉(zhuǎn)錄片段而被忽視。但是隨著高通量基因測序技術的出現(xiàn)，lncRNAs的研究逐漸深入，通過對一些具有特異性表達水平的IncRNAs進行具體研究和分析，發(fā)現(xiàn)lncRNAs在基因的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。目前關于lncRNAs的來源已達成5種共識:第一、具有蛋白質(zhì)編碼功能的mRNA由

4、于基因突變，從而失去其正常編碼的功能，形成了具有調(diào)控基因功能的lncRNAs;第二、由于染色體重排，導致一些距離較遠的基因片段互相靠近結(jié)合，構(gòu)成新的IncRNAs;第三、在逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座過程中，其形成重疊的片段;第四、由基因片段在復制的過程中重復而生成;第五、由于基因的插入，從而形成了新的lncRNAs。目前研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs可以通過作用于其臨近的基因發(fā)揮調(diào)控作用（正義調(diào)控），也能夠作用于其相鄰較遠的基因，從而發(fā)揮基因調(diào)控作用（反義調(diào)控

5、）。LncRNAs來源的研究對于探索其功能具有重要意義。
　　LncRNAs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要關系，目前研究逐漸認識到lncRNAs可能成為腫瘤診斷和治療的重要標志物和靶點。在診斷方面，由于腫瘤組織中的lncRNAs表達往往異常，且具有組織和種屬特異性，使其可能成為腫瘤標志物，尤其是在一些腫瘤的早期，由于其體積小，傳統(tǒng)的影像學方法不易發(fā)現(xiàn)。通過檢測血液中的lncRNAs，能夠便捷的了解病人罹患某種腫瘤的可能性。在治療方面，l

6、ncRNAs在腫瘤中發(fā)病機制中的研究為新的腫瘤治療靶點的選擇及研發(fā)新的高效、精準、低毒副作用的抗癌新藥提供了思路。目前l(fā)ncRNAs的研究還處于初級階段，對lncRNAs作用機制和功能的研究還在探索之中。
　　這些年隨著lncRNAs成為腫瘤研究中的熱門分子，在人類的各種腫瘤中，不斷有新的異常表達的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)。例如研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者腫瘤組織和血漿中HOTAIR的表達增高，且血漿中l(wèi)ncRNAHOTAIR水平與雌激素受體(

7、ER)水平和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關，進一步研究顯示血漿中HOTAIR水平可以作為乳腺癌診斷的潛在生物標志物。另有研究顯示lncRNACCAT2在前列腺癌中高表達且與前列腺癌的預后差相關，進一步研究顯示長鏈非編碼lncRNACCAT2能影響前列腺癌的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。此外，非小細胞肺癌中l(wèi)ncRNAGAS5-AS1的表達明顯低于癌旁正常肺組織。低表達GAS5-AS1與較大的腫瘤體積、較晚的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關。而異常

8、表達GAS5-AS1對細胞周期、凋亡及增殖沒有影響，但是能夠顯著影響非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲。在非小細胞肺癌細胞中過表達GAS5-AS1能夠減少ZEB1、N-鈣粘蛋白、波形蛋白及SNAIL1表達，從而影響其上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　近些年有關lncRNAs在結(jié)直腸癌中作用的報道越來越多。例如研究顯示lncRNAAFAP1-AS1在結(jié)直腸癌組織和HCT116和SW480細胞株中表達顯著上升。降低lncRNAAFAP1-AS1表達能

9、夠抑制SW480細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲。此外降低AFAP1-AS1能夠抑制腫瘤上皮-間充質(zhì)相關基因的表達。另有研究顯示lncRNASNHG20在結(jié)直腸癌組織中表達顯著上調(diào)，SNHG20高表達與患者TNM分期密切相關。多變量分析提示高表達SNHG20是結(jié)直腸癌患者總體生存期差的獨立預后因素。進一步的功能實驗表明，降低SNHG20表達能夠抑制細胞的增殖、侵襲和遷移，并影響結(jié)直腸癌細胞的細胞周期進程。此外，SNHG20調(diào)控細胞生長是通

10、過調(diào)節(jié)一系列的細胞周期相關基因?qū)崿F(xiàn)的。此外，研究顯示lncRNA ucoo2kmd.1通過競爭miR-211-3p調(diào)控CD44依賴性的大腸癌細胞的生長。而作為lncRNAs家族重要成員之一的GAPLINC，在結(jié)直腸癌中的功能目前仍然不清楚。
　　GAPLINC是一個長度為924bp的長鏈非編碼RNA，GAPLINC在胃癌組織中的表達高于對照組，相關性分析表明GAPLINC高表達與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關。生存分析結(jié)果顯示GAP

11、LINC高表達的胃癌患者其生存率較低表達患者低。研究顯示GAPLINC能夠通過調(diào)控CD44表達進而增強胃癌細胞的增殖與侵襲能力。進一步研究顯示GAPLINC調(diào)控CD44是通過作為miR-211-3P的ceRNA，從而調(diào)控CD44的表達。而GAPLINC在其它腫瘤中的研究較少。目前關于lncRNA GAPLINC在結(jié)直腸癌中的研究仍然較少。因此，研究GAPLINC在結(jié)直腸癌中的表達、功能及作用機制有非常重要的臨床意義。
　　我們通過

12、下面3部分的實驗對GAPLINC在結(jié)直腸癌中的功能進行了研究:第一、應用實時熒光定量PCR研究lncRNA GAPLINC在結(jié)直腸癌、癌旁組織及結(jié)直腸癌細胞系的表達情況;對結(jié)直腸癌患者臨床資料進行分析，評價其表達與各臨床病理特征的相關性，并預測其對結(jié)直腸癌患者預后的影響。第二、應用qRT-PCR實驗選擇高表達lncRNA GAPLINC的結(jié)直腸癌細胞系;設計針對GAPLINC特異性沉默的RNA小分子片段，分別轉(zhuǎn)染選定的結(jié)直腸癌細胞系，從

13、中選擇干擾效率最高的RNA小分子片段進行后續(xù)實驗。第三、體外實驗研究干擾lncRNA GAPLINC表達對結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲、細胞周期及凋亡等表型的影響;應用蛋白免疫印跡及細胞免疫熒光驗證GAPLINC激活Wnt/β-catenin信號通路影響結(jié)直腸癌細胞的生物學行為，進而明確lncRNAGAPLINC促進結(jié)直腸癌生長及進展的信號機制。
　　第一部分 LncRNA GAPLINC在結(jié)直腸癌中的表達及臨床意義
　　實

14、驗目的:檢測結(jié)直腸癌標本及結(jié)直腸癌細胞系中l(wèi)ncRNA GAPLINC的表達，研究其表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征及其預后的關系。
　　實驗方法:收集2007-2008年山東大學附屬齊魯醫(yī)院行根治性手術的64例結(jié)直腸癌病人的癌組織標本及匹配的癌旁正常組織,應用qRT-PCR檢測 lncRNAGAPLINC的表達水平并對患者臨床資料進行統(tǒng)計;qRT-PCR檢測lncRNAGAPLINC在結(jié)直腸癌細胞株及正常人腸上皮細胞系中的表達水平

15、。運用卡方檢驗和Fisher精確概率法分析lncRNA GAPLINC表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的相關性，應用Kaplan-Meier法繪制病人的生存曲線，log-rank檢驗比較兩組間生存率差異，運用多因素Cox比例回歸模型預測各個臨床指標的預后意義。
　　實驗結(jié)果:qRT-PCR結(jié)果表明結(jié)直腸癌病人腫瘤標本及結(jié)直腸癌細胞系中的lncRNA GAPLINC表達較對應癌旁正常組織及人腸上皮細胞系FHC細胞明顯增高(P＜0.05

16、)。相關性分析結(jié)果表明lncRNA GAPLINC與結(jié)直腸癌的局部浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期顯著性相關(P＜0.05)，而與病人年齡、性別、腫瘤大小及組織分化程度無顯著相關性（P＞0.05）。生存分析顯示lncRNAGAPLINC高表達的患者整體存活期明顯低于lncRNA GAPLINC低表達患者（P＜0.05）。多因素分析表明，GAPLINC是影響結(jié)直腸癌患者生存的獨立危險因素。
　　結(jié)論:LncRNA GAPLINC

17、在結(jié)直腸癌中高表達且與腫瘤的進展及預后密切相關，GAPLINC可能成為結(jié)直腸癌新的預后標志物和治療靶點。
　　關鍵詞:lncRNA; GAPLINC;結(jié)直腸癌;生存率;預后
　　第二部分 SiRNA靶向沉默結(jié)直腸癌細胞系lncRNA GAPLINC表達
　　實驗目的:篩選lncRNA GAPLINC表達水平較高的結(jié)直腸癌細胞系，設計并選擇出GAPLINC干擾效率最高的siRNA。
　　實驗方法:選擇3個結(jié)直腸癌細

18、胞系，并分別進行了qRT-RCR實驗檢測3個細胞系中l(wèi)ncRNA GAPLINC的表達水平。設計能特異性抑制lncRNA GAPLINC表達的siRNA片段，檢測其干擾效率。
　　實驗結(jié)果:3個結(jié)直腸癌細胞系中，HCT116和HT29具有相對較高的GAPLINC表達水平(P＜0.05)。序列為5'-GCCAUCUCCAUAACAUAAATT-3'的siRNA具有最明顯的基因沉默效應（P＜0.05）。
　　結(jié)論:成功篩選出ln

19、cRNA GAPLINC表達水平較高的結(jié)直腸癌細胞系，合成高效干擾片段，為后續(xù)實驗做準備。
　　關鍵詞: siRNA; GAPLINC;干擾
　　第三部分干擾lncRNA GAPLINC表達對結(jié)直腸癌細胞表型的影響及機制探討
　　實驗目的:體外實驗研究lncRNA GAPLINC對結(jié)直腸癌細胞系增殖、遷移、侵襲、細胞周期和凋亡等細胞表型的影響及可能機制。
　　實驗方法:將si-GAPLINC轉(zhuǎn)染GAPLINC高表

20、達的結(jié)直腸癌細胞系，應用CCK8實驗檢測結(jié)直腸癌細胞增殖，劃痕實驗分析細胞體外遷移能力，Matrigel侵襲實驗檢測結(jié)直腸癌細胞體外侵襲能力，流式細胞術對細胞凋亡及細胞周期進行分析。Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路下游蛋白的表達水平，運用細胞免疫熒光檢測β-catenin入核情況。
　　實驗結(jié)果:CCK8實驗表明低表達lncRNA GAPLINC能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細胞HCT116和HT29的增殖能力

21、(P＜0.05);劃痕實驗表明降低lncRNA GAPLINC表達后結(jié)直腸癌HCT116和HT29細胞系的遷移能力明顯下降（P＜0.05）;Matrigel侵襲實驗表明干擾lncRNA GAPLINC表達后結(jié)直腸癌HCT116和HT29細胞的侵襲能力顯著下降（P＜0.05）;流式細胞術分析結(jié)果表明HCT116和HT29細胞株沉默lncRNA GAPLINC表達后GO/G1期所占細胞數(shù)目顯著增高，與此同時S期的細胞數(shù)目顯著降低(P＜0.0

22、5);細胞凋亡顯示相對于對照組，lncRNAGAPLINC表達下調(diào)能夠促進結(jié)直腸癌細胞系HCT116和HT29的凋亡（P＜0.05）。Western blot及細胞免疫熒光結(jié)果顯示lncRNA GAPLINC能夠激活Wnt/β-catenin信號通路。
　　結(jié)論:體外實驗表明，lncRNA GAPLINC能夠增強結(jié)直腸癌細胞系的增殖、遷移及侵襲能力，并能顯著抑制細胞凋亡;lncRNA GAPLINC可能通過激活Wnt/β-cate