KLF9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一。在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)居民惡性腫瘤發(fā)病和死因順位中結(jié)直腸癌位居第二至第三。自Vogelstein提出經(jīng)典的結(jié)直腸癌多基因、多步驟的發(fā)生發(fā)展模式以來(lái)，許多與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因不斷被揭示。近二十余年來(lái)，隨著我國(guó)居民生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。因此，揭示隱藏在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中內(nèi)在的分子病理改變，將對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的深入了解以及該病的防治具有十分重要

2、的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。 結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多階段積累的復(fù)雜過(guò)程，正常結(jié)直腸上皮-腺瘤-腺癌順序發(fā)展的分子模型過(guò)程中涉及到許多基因的改變。在這些基因中有一類屬于轉(zhuǎn)錄因子，如TP53、DCC、SMAD4/DPC4等基因，這提示轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了重要作用。 KLF9(Krüppel-like factor 9，KLF9)鋅指轉(zhuǎn)錄因子是我們實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)結(jié)直腸癌電子表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)之

3、上，構(gòu)建整合TaqMan定量PCR和微流體技術(shù)的低密度芯片進(jìn)行篩選研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的在結(jié)直腸癌中低表達(dá)的基因。 KLF9屬于SP/KLF(specificity protein/Krüppel-like factor)家族轉(zhuǎn)錄因子，它在機(jī)體重要器官的發(fā)育以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮生物學(xué)功能。Klf9基因敲除小鼠腸隱窩細(xì)胞增殖和絨毛細(xì)胞遷移顯現(xiàn)異常。結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室前期篩選結(jié)果，KLF9與腸隱窩細(xì)胞增殖、絨毛遷移有關(guān)以及該家族其它基因

4、與人類常見惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)的現(xiàn)象，使我們提出疑問(wèn)，KLF9是否與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)呢?本課題以明確KLF9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)為切入點(diǎn)，繼而初步研究KLF9在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能，以期探索它在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 我們收集了2005年8月至2006年5月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院手術(shù)并經(jīng)病理學(xué)診斷為結(jié)直腸癌的病例70例，在手術(shù)過(guò)程中取得癌組織和遠(yuǎn)端切緣的正常粘膜。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)

5、、Western blot及免疫組織化學(xué)法對(duì)KLF9在結(jié)直腸癌組織及配對(duì)正常粘膜中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。 檢測(cè)結(jié)果顯示在mRNA水平上，正常結(jié)直腸粘膜KLF9表達(dá)明顯高于相應(yīng)癌組織(P<0.0001)。Western blot結(jié)果表明KLF9蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平下降或不表達(dá)(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建了包含結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸粘膜的組織芯片。組織芯片免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，大部分正常粘膜中可檢測(cè)到KLF9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)

6、胞(35/43)，而在結(jié)直腸癌組織中，僅4例癌組織KLF9呈陽(yáng)性表達(dá)(4/43)，其余癌組織均無(wú)表達(dá)(P<0.001)。KLF9表達(dá)與結(jié)直腸癌病人臨床病理參數(shù)(腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤部位)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。運(yùn)用RT-PCR和Western blot檢測(cè)了KLF9在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)。PCR擴(kuò)增結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29、SW480、SW620、RKO KLF9基因編碼區(qū)序列后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上比對(duì)，我們

7、發(fā)現(xiàn)RKO細(xì)胞KLF9編碼區(qū)存在518T>C(F173S)突變，但此突變并不影響KLF9蛋白在RKO細(xì)胞系中的表達(dá)。 采用生物信息學(xué)方法，利用NCBI、ExPASy、PBIL、SWISS-MODEL、ESyPred3D、Rosmal等在線服務(wù)網(wǎng)站和生物信息學(xué)軟件，對(duì)RKO細(xì)胞KLF9蛋白和正常KLF9蛋白(NP_001197)分析比較結(jié)果顯示，RKO細(xì)胞KLF9蛋白在一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上均與正常KLF9蛋白存在差異。HT29、

8、SW480、SW620細(xì)胞系KLF9編碼區(qū)中未檢測(cè)到突變存在。基于KLF9在結(jié)直腸癌中表達(dá)下降的現(xiàn)象，我們對(duì)KLF9在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步探討。在成功構(gòu)建含有KLF9編碼區(qū)的真核表達(dá)載體(pcDNA3.1-KLF9)基礎(chǔ)上，借助脂質(zhì)體PolyFect將KLF9轉(zhuǎn)染到結(jié)直腸癌細(xì)胞系中探討其在結(jié)直腸癌中的潛在功能。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF9到SW480、SW620、RKO及Caco2細(xì)胞系，對(duì)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡進(jìn)

9、行了分析。 從形態(tài)學(xué)觀察轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)KLF9對(duì)細(xì)胞周期有影響。Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)也未見KLF9對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染前后與細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin D1、p21(Cip1)、CDK2、PCNA的表達(dá)水平無(wú)明顯改變(P>0.05)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF9到內(nèi)源性KLF9蛋白微弱表達(dá)和不表達(dá)的SW480和C

10、aco2細(xì)胞系中，以期篩選出穩(wěn)定表達(dá)克隆進(jìn)行后續(xù)研究。在三次穩(wěn)定篩選過(guò)程中，當(dāng)篩選進(jìn)行到擴(kuò)大培養(yǎng)階段時(shí)，轉(zhuǎn)染KLF9的細(xì)胞出現(xiàn)死亡，未能得到穩(wěn)定表達(dá)KLF9的細(xì)胞株。 通過(guò)以上關(guān)于KLF9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能的初步探索，我們得出以下結(jié)論： 1.KLF9 mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)均下降，可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)； 2.在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中KLF9 mRNA和蛋白表達(dá)水平不一致，在不同細(xì)胞系