‘碭山酥梨’及其芽變品系COMT基因和MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆表達分析.pdf

1、梨果皮顏色是評價果實商品價值的一項重要指標，一直以來備受人們關注。2001年，在安徽省碭山縣發(fā)現(xiàn)一株‘碭山酥梨’果實發(fā)生了變異，果皮由黃色變成了褐色。經(jīng)過三年定點觀察發(fā)現(xiàn)，變異性狀在芽變母株中表現(xiàn)穩(wěn)定，而且異地高接的試驗也表明，高接樹的葉片、果實形態(tài)特征以及其品質(zhì)特性均與變異母樹相一致，分子標記分析確定其遺傳上發(fā)生變異，暫時稱為‘銹酥’。對梨果皮褐色形成的原因已有報道，但對其形成的分子機理研究較少。為了探究‘碭山酥梨’果實褐皮芽變形成機

2、理，本試驗以‘銹酥’盛花后150 d的果皮為材料，克隆了木質(zhì)素生物合成關鍵酶基因PbCOMT1、PbCOMT2以及PbMYBR、PbMYB31轉(zhuǎn)錄因子，并分析了不同基因在不同組織的特異性表達。應用實時熒光定量RT-PCR分析了PbCOMT1、PbCOMT2、PbMYBR和PbMYB31基因在‘碭山酥梨’和‘銹酥’盛花后不同時期的相對表達量。同時，利用相關軟件對PbCOMT1和PbCOMT2基因的啟動子進行作用原件分析。試驗獲得主要結(jié)果如

3、下:
　　1.利用SSH以及RT-PCR技術獲得PbCOMT1、PbCOMT2、PbMYBR和PbMYB31基因的全長序列，其中PbCOMT1比對后與GenBank中已知的‘碭山酥梨’COMT（登錄號:KC905086.1）相同，本文暫命名為PbCOMT1。生物信息學分析表明，PbCOMT1基因全長cDNA序列為1371 bp，包含一個1098 bp的開放閱讀框，編碼365個氨基酸，推測到該蛋白的分子式為C1802H2808N45

4、6O522S23，分子質(zhì)量為39950.2，等電點為5.52。PbCOMT2基因全長cDNA序列為1405 bp，包含一個900 bp的開放閱讀框，編碼299個氨基酸，推測到該蛋白的分子式為C1483H2268N392O411S20，分子質(zhì)量為32805.9，等電點為6.59。PbMYBR基因全長cDNA序列為1579 bp，序列編碼區(qū)(CDS)為1386 bp，編碼一個461個氨基酸，推測到該蛋白的分子式為C2146H3403N645

5、O716S18，等電點為6.74。PbMYB31基因全長cDNA序列為1198 bp，從第1個堿基到第1131個堿基為編碼區(qū)，編碼376個氨基酸，推測到該蛋白的分子式為C1802H2810N534O586S12，等電點為6.12。
　　2.半定量RT-PCR結(jié)果顯示，PbCOMT1在果皮、果肉和葉片中均有表達，在果皮中的表達量相對較大，具有組織表達特異性。以GAPDH基因為內(nèi)參，進行PbCOMT1基因的實時熒光定量分析，結(jié)果顯示，

6、該基因在‘銹酥’以及‘碭山酥梨’盛花后25 d、75 d、150 d均有表達，但在花后150 d表達最低。此外，在這三個時期，PbCOMT1在‘銹酥’中的表達量成下降趨勢，而在‘碭山酥梨’中的表達量成先升后降的趨勢。在盛花后25 d，PbCOMT1在‘銹酥’中的表達量約為‘碭山酥梨’的10倍。說明該基因在‘碭山酥梨’以及‘銹酥’果皮發(fā)育的幼果時期的差異表達可能在‘銹酥’果皮褐變的過程中發(fā)揮作用。半定量RT-PCR結(jié)果表明:PbCOMT2

7、在果皮中表達，在果肉和葉片中幾乎不表達。熒光實時定量PCR結(jié)果表明:在盛花后25 d、75 d、150 d，‘碭山酥梨’果皮中PbCOMT2基因相對表達量均低于‘銹酥’。兩者在果實成熟期(花后150d)，PbCOMT2表達量最高，前者約為后者的2倍。其次是果實發(fā)育中期(花后75 d)，兩者相差不大。最后為幼果時期（花后25d）。雖然在幼果時期(花后25d)表達量最低，但PbCOMT2在‘銹酥’里的表達量卻約為‘碭山酥梨’的10倍。說明該

8、基因表達量的差異可能是‘銹酥’褐皮形成的重要因子之一。
　　3.以GAPDH基因為內(nèi)參，進行PbMYBR和PbMYB31基因的實時熒光定量分析。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，PbMYBR和PbMYB31在果皮、果肉和葉片中均有表達，在葉片中的表達量最高，具有組織特異性。PbMYBR和PbMYB31基因在‘銹酥’以及‘碭山酥梨’花后25d均有表達，PbMYBR基因在‘銹酥’中的表達量比‘碭山酥梨’高，前者約為后者的10倍。而PbMY

9、B31基因在‘銹酥’中的表達量也比‘碭山酥梨’高，前者約為后者的4倍。說明PbMYBR和PbMYB31基因表達量的差異可能是‘銹酥’褐皮形成的重要因子之一。
　　4.用PLACE(plant cis-acting regulatory DNA elements)在線服務器，對PbCOMT1與PbCOMT2啟動子進行作用原件分析。PbCOMT1與PbCOMT2啟動子具有多個一般真核生物啟動子結(jié)構(gòu)具有的保守序列CAAT-box和TAT