‘碭山酥梨’及其芽變品系COMT基因和MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆表達(dá)分析.pdf

1、梨果皮顏色是評(píng)價(jià)果實(shí)商品價(jià)值的一項(xiàng)重要指標(biāo)，一直以來備受人們關(guān)注。2001年，在安徽省碭山縣發(fā)現(xiàn)一株‘碭山酥梨’果實(shí)發(fā)生了變異，果皮由黃色變成了褐色。經(jīng)過三年定點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn)，變異性狀在芽變母株中表現(xiàn)穩(wěn)定，而且異地高接的試驗(yàn)也表明，高接樹的葉片、果實(shí)形態(tài)特征以及其品質(zhì)特性均與變異母樹相一致，分子標(biāo)記分析確定其遺傳上發(fā)生變異，暫時(shí)稱為‘銹酥’。對(duì)梨果皮褐色形成的原因已有報(bào)道，但對(duì)其形成的分子機(jī)理研究較少。為了探究‘碭山酥梨’果實(shí)褐皮芽變形成機(jī)

2、理，本試驗(yàn)以‘銹酥’盛花后150 d的果皮為材料，克隆了木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶基因PbCOMT1、PbCOMT2以及PbMYBR、PbMYB31轉(zhuǎn)錄因子，并分析了不同基因在不同組織的特異性表達(dá)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析了PbCOMT1、PbCOMT2、PbMYBR和PbMYB31基因在‘碭山酥梨’和‘銹酥’盛花后不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，利用相關(guān)軟件對(duì)PbCOMT1和PbCOMT2基因的啟動(dòng)子進(jìn)行作用原件分析。試驗(yàn)獲得主要結(jié)果如

3、下:
　　1.利用SSH以及RT-PCR技術(shù)獲得PbCOMT1、PbCOMT2、PbMYBR和PbMYB31基因的全長序列，其中PbCOMT1比對(duì)后與GenBank中已知的‘碭山酥梨’COMT（登錄號(hào):KC905086.1）相同，本文暫命名為PbCOMT1。生物信息學(xué)分析表明，PbCOMT1基因全長cDNA序列為1371 bp，包含一個(gè)1098 bp的開放閱讀框，編碼365個(gè)氨基酸，推測到該蛋白的分子式為C1802H2808N45

4、6O522S23，分子質(zhì)量為39950.2，等電點(diǎn)為5.52。PbCOMT2基因全長cDNA序列為1405 bp，包含一個(gè)900 bp的開放閱讀框，編碼299個(gè)氨基酸，推測到該蛋白的分子式為C1483H2268N392O411S20，分子質(zhì)量為32805.9，等電點(diǎn)為6.59。PbMYBR基因全長cDNA序列為1579 bp，序列編碼區(qū)(CDS)為1386 bp，編碼一個(gè)461個(gè)氨基酸，推測到該蛋白的分子式為C2146H3403N645

5、O716S18，等電點(diǎn)為6.74。PbMYB31基因全長cDNA序列為1198 bp，從第1個(gè)堿基到第1131個(gè)堿基為編碼區(qū)，編碼376個(gè)氨基酸，推測到該蛋白的分子式為C1802H2810N534O586S12，等電點(diǎn)為6.12。
　　2.半定量RT-PCR結(jié)果顯示，PbCOMT1在果皮、果肉和葉片中均有表達(dá)，在果皮中的表達(dá)量相對(duì)較大，具有組織表達(dá)特異性。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行PbCOMT1基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析，結(jié)果顯示，

6、該基因在‘銹酥’以及‘碭山酥梨’盛花后25 d、75 d、150 d均有表達(dá)，但在花后150 d表達(dá)最低。此外，在這三個(gè)時(shí)期，PbCOMT1在‘銹酥’中的表達(dá)量成下降趨勢(shì)，而在‘碭山酥梨’中的表達(dá)量成先升后降的趨勢(shì)。在盛花后25 d，PbCOMT1在‘銹酥’中的表達(dá)量約為‘碭山酥梨’的10倍。說明該基因在‘碭山酥梨’以及‘銹酥’果皮發(fā)育的幼果時(shí)期的差異表達(dá)可能在‘銹酥’果皮褐變的過程中發(fā)揮作用。半定量RT-PCR結(jié)果表明:PbCOMT2

7、在果皮中表達(dá)，在果肉和葉片中幾乎不表達(dá)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明:在盛花后25 d、75 d、150 d，‘碭山酥梨’果皮中PbCOMT2基因相對(duì)表達(dá)量均低于‘銹酥’。兩者在果實(shí)成熟期(花后150d)，PbCOMT2表達(dá)量最高，前者約為后者的2倍。其次是果實(shí)發(fā)育中期(花后75 d)，兩者相差不大。最后為幼果時(shí)期（花后25d）。雖然在幼果時(shí)期(花后25d)表達(dá)量最低，但PbCOMT2在‘銹酥’里的表達(dá)量卻約為‘碭山酥梨’的10倍。說明該

8、基因表達(dá)量的差異可能是‘銹酥’褐皮形成的重要因子之一。
　　3.以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行PbMYBR和PbMYB31基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，PbMYBR和PbMYB31在果皮、果肉和葉片中均有表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量最高，具有組織特異性。PbMYBR和PbMYB31基因在‘銹酥’以及‘碭山酥梨’花后25d均有表達(dá)，PbMYBR基因在‘銹酥’中的表達(dá)量比‘碭山酥梨’高，前者約為后者的10倍。而PbMY

9、B31基因在‘銹酥’中的表達(dá)量也比‘碭山酥梨’高，前者約為后者的4倍。說明PbMYBR和PbMYB31基因表達(dá)量的差異可能是‘銹酥’褐皮形成的重要因子之一。
　　4.用PLACE(plant cis-acting regulatory DNA elements)在線服務(wù)器，對(duì)PbCOMT1與PbCOMT2啟動(dòng)子進(jìn)行作用原件分析。PbCOMT1與PbCOMT2啟動(dòng)子具有多個(gè)一般真核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)具有的保守序列CAAT-box和TAT