蛋白尿引起腎小管間質損傷新機制——NLRP3炎性體及TLR2、TLR4信號通路激活.pdf

1、目的:蛋白尿是許多腎臟疾病的常見癥狀，蛋白尿不僅是腎小球、腎小管疾病導致的結果，其本身還可直接損傷腎小管上皮細胞，通過刺激腎小管上皮細胞產(chǎn)生各種細胞因子、趨化因子等，介導間質的慢性炎性反應及纖維化過程，是影響慢性腎臟病預后的獨立危險因素，但蛋白尿導致腎臟損傷的確切機制尚不明確。NLRP3炎性體是目前研究最為明確的炎性體，它通過識別各種病原體相關分子模式和細胞內損傷相關分子模式，激活下游信號通路，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，近

2、年來NLRP3炎性體在各種腎臟疾病中的作用也備受關注。本研究旨在應用蛋白負荷腎病大鼠模型、體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞及非IgA腎病系膜增生性腎小球腎炎患者的腎活檢組織，探討蛋白尿對腎小管上皮細胞中NLRP3炎性體及TLR2/TLR4-MyD88-NF-κB信號通路激活的影響，以闡明蛋白尿導致腎臟損傷的可能機制。
　　方法:建立蛋白負荷腎病大鼠模型，每天經(jīng)腹腔注射BSA（5g/kg）9周，大鼠分為對照組、蛋白負荷腎病模型組;體外實驗用

3、高濃度的(20mg/ml) BSA刺激人近端腎小管上皮細胞HK-2細胞;選取30例不同蛋白尿水平的非IgA腎病系膜增生性腎小球腎炎患者的腎活檢組織;分別用免疫組化、Western blot和real-time PCR檢測蛋白負荷對腎小管上皮細胞中NLRP3炎性體及TLR2/TLR4-MyD88-NF-κB信號通路的激活及其下游炎癥因子IL-1β和IL-18以及TNF-α和IL-6的表達情況。進一步分別用高濃度KCl(150mM)、CA0

4、74Me（組織蛋白酶B抑制劑）以及DPI（ROS抑制劑）作用于BSA刺激的HK-2細胞，通過檢測炎癥因子IL-1β和IL-18生成的變化情況，探討蛋白負荷激活腎小管上皮細胞NLRP3炎性體的機制。另外，用BAY11-7082（NF-κB抑制劑）作用于HK-2細胞，用siRNA分別沉默HK-2細胞中的TLR2和TLR4后，通過檢測炎癥因子IL-1β和IL-18及TNF-α和IL-6生成的變化情況，探討 TLR2/TLR4-MyD88-NF

5、-κB信號通路是否參與蛋白負荷導致的腎臟損傷。
　　結果:蛋白負荷腎病模型組大鼠出現(xiàn)蛋白尿，腎小管上皮細胞明顯損傷，管腔內見較多蛋白管型，部分腎小管擴張或灶性萎縮，間質中有較多淋巴細胞和單核巨噬細胞浸潤，小管間質損傷評分顯著高于對照組（P＜0.05）。免疫組化結果顯示，在蛋白負荷腎病大鼠腎組織中，NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18不僅表達在炎癥細胞中，還可以表達于腎小管上皮細胞胞漿中。Western blot和

6、real-time PCR結果也顯示，蛋白負荷腎病模型組大鼠腎組織和體外BSA刺激的HK-2細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA水平較對照組均明顯升高（P＜0.05，或P＜0.01）。在非IgA腎病系膜增生性腎小球腎炎患者的腎活檢組織中，免疫組化結果表明蛋白尿水平較高的患者腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達明顯強于蛋白尿水平較低者，且IL-1β和IL-18的表達量

7、與24h尿蛋白量呈正相關(r=0.836，P＜0.05;r=0.901，P＜0.05)。同時在蛋白負荷腎病大鼠腎組織中TLR2/TLR4-MyD88-NF-κB信號通路激活，其激活后產(chǎn)生的TNF-α和IL-6也較對照組明顯升高。Western blot和real-time PCR結果也顯示，蛋白負荷腎病模型組大鼠腎組織和體外BSA刺激的HK-2細胞中TLR2/TLR4-MyD88-NF-κB信號通路激活，產(chǎn)生的pro-IL-1β和pro

8、-IL-18及TNF-α和IL-6均明顯升高（P＜0.05，或P＜0.01）。在非IgA腎病系膜增生性腎小球腎炎患者的腎活檢組織中，免疫組化結果表明蛋白尿水平較高的患者腎組織中TLR2/TLR4-MyD88-NF-κB信號通路激活，TNF-α和IL-6的表達也明顯高于蛋白尿水平較低者，且TNF-α和IL-6的表達量與24h尿蛋白量呈正相關(r=0.813，P＜0.05; r=0.899，P＜0.05)。在體外實驗中，CA074Me和DP

9、I作用于BSA刺激的HK-2細胞后，可使IL-1β和IL-18的生成明顯下降(P＜0.05，或P＜0.01)，但高濃度KCl對IL-1β和IL-18的生成無明顯影響。用BAY11-7082抑制NF-κB后，BSA刺激的HK-2細胞中IL-1β和IL-18及TNF-α和IL-6的生成明顯減少(P＜0.05，或P＜0.01)。用siRNA分別沉默TLR2和TLR4也可明顯降低BSA刺激的HK-2細胞中IL-1β和IL-18及TNF-α和IL

10、-6的生成(P＜0.05，或P＜0.01)。
　　結論:1、蛋白尿可導致腎小管上皮細胞NLRP3炎性體激活，通過活化caspase-1，引起炎癥因子IL-1β和IL-18分泌。
　　2、蛋白尿可導致腎小管上皮細胞TLR2/TLR4-MyD88-NF-κB信號通路的激活，促進TNF-α、IL-6、pro-IL-1β和pro-IL-18產(chǎn)生增加。
　　3、蛋白尿通過引起組織蛋白酶B釋放和ROS產(chǎn)生而激活NLRP3炎性體，而