NIRF蛋白與HBV核心蛋白的相關性研究.pdf

1、目的：1.檢測NIRF蛋白和HBV核心蛋白在人正常肝組織和HBV感染的肝組織內表達的相關性；檢測人正常肝組織和肝癌組織中NIRF基因的蛋白表達情況；2.構建NIRF基因真核表達載體，并轉染人胚腎上皮細胞HEK-293；3.構建好的重組載體轉染能分泌HBV DNA的HepG2.2.15細胞，觀察NIRF蛋白與HBV核心蛋白在細胞內的定位。 方法：1.通過免疫組化方法檢測人正常肝組織（n=25）、HBV感染的肝組織（n=25）中NI

2、RF蛋白和HBV核心蛋白表達的相關性，并分析NIRF基因的蛋白表達是否有差異；通過免疫組化方法檢測人正常肝組織（n=25）、肝癌組織（n=25）中NIRF基因的蛋白表達情況；2.通過RT-PCR方法，從人肝癌組織中獲得NIRF基因，將其插入真核表達載體pIRES2-EGFP中，構建成重組載體pIRES2-EGFP-NIRF，并轉入大腸桿菌DH5α，篩選出含有正確插入片段的克隆，經(jīng)PCR、酶切及DNA測序鑒定；實驗分三組：HEK-293-

3、NIRF組（利用脂質體將構建成功的重組載體轉染HEK-293細胞）、HEK-293-Null組（空載體轉染HEK-293細胞）、HEK-293組（未轉染的HEK-293細胞）；采用PCR技術和Western blotting方法分別檢測三組中NIRF mRNA及蛋白水平的表達，成功建立細胞轉染模型；3.構建好的重組載體pIRES2-EGFP-NIRF轉染能分泌HBV DNA的HepG2.2.15細胞，通過免疫熒光檢測NIRF蛋白和HBV

4、核心蛋白在細胞內的定位。 結果：1.通過免疫組化法檢測蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)NIRF蛋白含量與HBV核心蛋白（HBV-CP）含量呈正相關；人肝癌組織中NIRF蛋白表達明顯高于在人肝正常組織中的表達；2.利用酶切、PCR分析、DNA測序證實，重組載體即NIRF真核表達載體pIRES2-EGFP-NIRF構建成功；經(jīng)PCR和Western blotting證實，人胚腎上皮細胞HEK-293中無NIRF的轉錄及翻譯，是進行NIRF轉染的良好

5、細胞模型，重組載體轉染HEK-293細胞后，經(jīng)PCR和Western blotting證實轉染成功；3.重組載體pIRES2-EGFP-NIRF轉染能分泌HBV核心蛋白（HBV-CP）的HepG2.2.15細胞，通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)NIRF蛋白和HBV核心蛋白（HBV-CP）在細胞內有共同的亞細胞定位。 結論：NIRF具有泛素化能力，HBV-CP的第7位和第96位Lys殘基具有被泛素化的分子基礎；在肝細胞內NIRF的含量與HBV