活性氧誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性線粒體途徑的研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡，由基因控制并能夠自主有序的死亡，具有一系列的形態(tài)學(xué)及生化特征，在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖及壓力應(yīng)激等生命歷程上起著關(guān)鍵作用。氧壓能夠調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞生存，由活性氧介導(dǎo)的高氧壓可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。家蠶作為鱗翅目昆蟲(chóng)的模式生物，逐漸成為研究熱點(diǎn)，但對(duì)氧壓誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞凋亡的研究尚處于初級(jí)階段，其相應(yīng)的凋亡途徑的研究目前還不清楚。本研究基于已報(bào)道的家蠶凋亡相關(guān)基因，與具有較強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)的鱗翅目典型代表草地貪夜蛾細(xì)胞相比較，論證了活性氧介導(dǎo)

2、的高氧壓誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞凋亡有線粒體信號(hào)通路的參與，這將為進(jìn)一步解析家蠶細(xì)胞凋亡的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.活性氧誘導(dǎo)家蠶BmN-SWU1細(xì)胞凋亡模型的建立
　　用0.1μM、1μM、5μM及10μMH2O2分別處理BmN-SWU1與sf9細(xì)胞0-24h、0-12h，，采用MTT分析、DAPI染色、流式分析及TUNEL染色的方法分別檢測(cè)細(xì)胞的活力、形態(tài)、凋亡率及DNA斷裂。結(jié)果發(fā)現(xiàn):用1μM H2O2分別處理

3、兩種細(xì)胞24h、12h時(shí)，細(xì)胞致死率接近50％，且DNA發(fā)生了斷裂。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞呈現(xiàn)一系列的凋亡特征:細(xì)胞皺縮、胞質(zhì)凝聚、凋亡小體出現(xiàn)，且細(xì)胞凋亡的發(fā)生對(duì)H2O2呈時(shí)間依賴性。綜上，1μMH2O2分別處理BmN-SWU1與sf9細(xì)胞24h、12h，是誘導(dǎo)兩種昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡的最佳條件。
　　2.活性氧誘導(dǎo)家蠶BmN-SWU1細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性線粒體途徑的研究
　　1μM H2O2分別處理BmN-SWU1與sf9細(xì)胞不同

4、時(shí)間，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，線粒體分布逐漸由均勻分布向簇狀、彌散狀分布轉(zhuǎn)化，表明H2O2影響兩種昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的線粒體分布;同時(shí)檢測(cè)到線粒體膜電位呈時(shí)間依賴性下降，流式結(jié)果還顯示在BmN-SWU1細(xì)胞中，8h與0h時(shí)的線粒體膜電位相比，無(wú)顯著性差異。與此同時(shí)，與H2O2誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS與Ca2+水平也逐漸升高。qPCR分析表明:H2O2可通過(guò)上調(diào)BmDronc、Bmapaf-1、BmICE，BmEndoG、BmP53、BmDre

5、dd和下調(diào)BmBuffy，BmIAP基因的表達(dá)，誘導(dǎo)BmN-SWU1細(xì)胞凋亡。免疫熒光和western-blot結(jié)果表明:H2O2可以促進(jìn)細(xì)胞色素C的表達(dá)，并從線粒體向胞質(zhì)釋放，除此之外，還可上調(diào)P53和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。Caspase-9與3/7酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示:H2O2處理BmN-SWU1與sf9細(xì)胞不同時(shí)間后，其Caspase-9與Caspase-3/7酶活性升高。綜上，本研究論證了H2O2介導(dǎo)的氧壓誘導(dǎo)家蠶BmN-SW