病原物誘導(dǎo)啟協(xié)子GST1響應(yīng)柑橘潰瘍病誘導(dǎo)的功能結(jié)構(gòu)域研究.pdf

1、柑橘潰瘍病(Citrus canker)是由地毯黃單胞桿菌柑橘致病變種(Xanthomonasnxonopodis pv.citri)引起的一種細(xì)菌性病害，目前尚無有效的方法可以根除柑橘潰瘍病。利用病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控抗病基因的表達(dá)已成為植物抗病基因工程育種的主要策略之一。GST1病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子來源于馬鈴薯，對(duì)病原菌具有廣譜的響應(yīng)。在轉(zhuǎn)基因錦橙中，創(chuàng)傷和潰瘍病菌侵染能高效誘導(dǎo)GST1控制的GUS報(bào)告基因的表達(dá)。因此通過解析GST1啟動(dòng)子

2、順式元件區(qū)域的功能，確定其誘導(dǎo)核心區(qū)域，為GST1啟動(dòng)子改造、柑橘抗性育種等提供重要的理論依據(jù)。
　　本研究對(duì)病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子GST1順式元件進(jìn)行了功能分析，主要結(jié)果如下:
　　1.GST1啟動(dòng)予的生物信息學(xué)分析
　　對(duì)長(zhǎng)1571 bp GST1啟動(dòng)子潛在的受病原菌誘導(dǎo)的順式元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。GST1啟動(dòng)子基因組序列上含有5個(gè)W box(TTGACC/T)、3個(gè)GT1 box(GAAAAA)、12個(gè)dof box(AA

3、AG)、2個(gè)Gbox(CACNTG)、1個(gè)Sbox(AGCCACC)和1個(gè)GST1 box。
　　2.不同缺失型啟動(dòng)子的克隆
　　在上述分析基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，5'端缺失法擴(kuò)增GST1啟動(dòng)子，獲得長(zhǎng)1156bp（缺失-1571/-1158區(qū)域，產(chǎn)生的啟動(dòng)子命名為G1）、746bp（缺失-1158/-748區(qū)域，產(chǎn)生的啟動(dòng)子命名為G2）、314bp（缺失-747/-315區(qū)域，產(chǎn)生的啟動(dòng)子命名為G3）、187bp（缺失

4、-314/-188區(qū)域，產(chǎn)生的啟動(dòng)子命名為G4）缺失型啟動(dòng)子4個(gè)，T-克隆，測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確的不同缺失型的啟動(dòng)子序列。
　　3.不同缺失型啟動(dòng)子與GUS基因融合載體的構(gòu)建
　　用HindⅢ/BamHⅠ酶切4個(gè)缺失型啟動(dòng)子T-克隆載體和p1300GNGM載體，構(gòu)建不同缺失型啟動(dòng)子調(diào)控GUS基因的植物表達(dá)載體:pG1∶GUS、pG2∶GUS、pG3∶GUS和pG4∶GUS。
　　4.不同缺失型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株的獲得及鑒定

5、
　　通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pG1∶GUS、pG2∶GUS、pG3∶GUS和pG4∶GUS植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化錦橙，經(jīng)GFP熒光檢測(cè)、PCR和Southern blot分析共獲得了36株轉(zhuǎn)基因錦橙。
　　5.不同缺失型啟動(dòng)子的傷誘導(dǎo)特異性表達(dá)分析
　　對(duì)不同缺失型啟動(dòng)子傷誘導(dǎo)GUS基因的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR和GUS酶活性分析。結(jié)果表明，pG3∶GUS可高效響應(yīng)創(chuàng)傷誘導(dǎo)，pG1∶GUS、pG2∶GUS和pG4∶GUS幾乎不響應(yīng)

6、創(chuàng)傷誘導(dǎo)。
　　6，不同缺失型啟動(dòng)子的潰瘍病病原菌誘導(dǎo)特異性表達(dá)分析
　　對(duì)不同缺失型啟動(dòng)予潰瘍病誘導(dǎo)激活GUS基因的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR和GUS酶活性分析。結(jié)果表明，pG3∶GUS可高效響應(yīng)潰瘍病誘導(dǎo)，pG1∶GUS、pG2∶GUS和pG4∶GUS幾乎不響應(yīng)潰瘍病誘導(dǎo)。
　　綜上所述:-1571/-1158區(qū)域和-314/-188區(qū)域的缺失顯著影響GST1啟動(dòng)子受潰瘍病病原菌和創(chuàng)傷的誘導(dǎo)，這兩段區(qū)域含有正向調(diào)控潰瘍