半滑舌鰨皮膚潰瘍病病原及免疫保護(hù)研究.pdf

1、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）個(gè)體大、生長快、肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富，其品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值位居鰨類之首，當(dāng)前，其人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，然而，養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的各類疾病則給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來負(fù)面影響。皮膚潰瘍病是近年來在養(yǎng)殖半滑舌鰨中新出現(xiàn)的一種細(xì)菌性疾病，本文對其病原進(jìn)行研究，并以分離鑒定的致病菌為基礎(chǔ)進(jìn)行了滅活疫苗和減毒疫苗的制備及相關(guān)免疫保護(hù)效果探討，目的在于了解該病原的生物學(xué)特性并為該病的綠色防控積累資

2、料。
　　從患有皮膚潰瘍病的半滑舌鰨病灶分離得到4株優(yōu)勢菌，經(jīng)人工注射感染證實(shí)菌株A3、BV1為引起養(yǎng)殖半滑舌鰨皮膚潰瘍病的主要病原，其半數(shù)致死量LD50分別為1.5×104.2cfu/mL、6.7×103cfu/mL。對這2株致病菌進(jìn)行了形態(tài)特征、理化特性、胞外產(chǎn)物酶活性與溶血活性及對抗菌類藥物的敏感性等生物學(xué)性狀的研究與分析。同時(shí)，測定它們的16SrRNA、gyrB基因序列，分析其相應(yīng)序列的同源性并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合菌株A3

3、、BV1的生理生化特征和16S rRNA、gyrB基因序列分析，確認(rèn)這兩株菌分別為哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）和輪蟲弧菌（V. rotiferianus）。胞外產(chǎn)物酶活性及溶血活性檢測結(jié)果表明，菌株A3具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明膠酶活性，在含有4％羊血的TSA平板上呈β溶血活性；菌株BV1具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶和卵磷脂酶活性，而不具有蛋白酶和明膠酶活性，在含有4％羊血的TSA平板上呈β溶血

4、活性。藥物敏感性分析結(jié)果顯示，菌株A3對四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氟哌酸、磺胺異惡唑、氧氟沙星、新生霉素、萘啶酸、氟啶酸和左氧氟沙星敏感，而對其他抗生素低度敏感或具有一定的抗性；菌株BV1對鏈霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、諾氟沙星、磺胺異噁唑、復(fù)方磺胺甲噁唑、萘啶酸和左氧氟沙星敏感，而對其他抗生素低敏或具有一定的抗性。
　　以上述致病性哈維氏弧菌為抗原，采用福爾馬林滅活方法制備了滅活疫苗并接種免疫半滑舌鰨，通過檢測受免魚的血清凝集抗體效價(jià)、溶菌

5、酶活性、酸性磷酸酶活性、血清補(bǔ)體活性、血清蛋白含量、頭腎白細(xì)胞吞噬殺傷活性等免疫相關(guān)指標(biāo)及機(jī)體針對該病原攻毒后的免疫保護(hù)力，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨經(jīng)疫苗免疫后35d內(nèi)血清中抗體凝集效價(jià)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，但在免疫期間總體上保持較高的水平。同時(shí)，血清溶菌酶含量、酸性磷酸酶活性、血清蛋白含量與對照組相比都有明顯的差異（P<0.05）。接種疫苗30d后的病原攻毒試驗(yàn)表明，受免半滑舌鰨的免疫保護(hù)力可達(dá)60％。由此可見，哈維氏弧菌滅活疫苗對半滑舌鰨有較

6、顯著的免疫保護(hù)效應(yīng)，可作為預(yù)防哈維氏弧菌感染的疫苗。
　　為了進(jìn)一步探討減毒活疫苗對半滑舌鰨的免疫保護(hù)效果，首先利用利福平篩選了具有利福平抗性的減毒株，并分析其相關(guān)生物學(xué)特性。利福平處理后獲得的減毒株菌落較小、生長緩慢、運(yùn)動性較弱，通過BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)檢測該菌株對95種不同碳源的利用情況，結(jié)果顯示野生菌株和減毒株的相似性為78.1％；在基因水平上，通過16S rRNA基因序列分析顯示減毒株與野生菌株僅有一個(gè)堿基差異，表明

7、篩選出來的減毒株在分類水平上并沒有發(fā)生變化；REP-PCR分析則表明，減毒株與野生菌株具有相同的BOX和ERIC-PCR帶型，而（GTG）5-PCR帶型不同，減毒株的（GTG）5-PCR圖譜比野生菌株多一條；用Sackosyal法提取細(xì)菌外膜蛋白，用酚水法提取LPS，比較了減毒株與野生菌株的OMP和LPS的SDS-PAGE電泳圖譜，結(jié)果顯示減毒株的OMP和LPS帶型與野生菌株不同，且條帶數(shù)都明顯減少。
　　以上述具有利福平抗性的減

8、毒株為免疫原經(jīng)腹腔注射免疫半滑舌鰨并通過測定受免魚的血清凝集抗體效價(jià)、溶菌酶含量、酸性磷酸酶活性、頭腎白細(xì)胞吞噬殺傷活性、頭腎白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性、頭腎白細(xì)胞MPO活性和NO活性等免疫相關(guān)指標(biāo)及病原攻毒后機(jī)體免疫保護(hù)力來評價(jià)減毒疫苗對半滑舌鰨的免疫保護(hù)效果，結(jié)果表明，接種疫苗后28d內(nèi)受免半滑舌鰨的血清中抗體凝集效價(jià)呈先升高的趨勢，同時(shí)，血清溶菌酶含量、酸性磷酸酶活性、吞噬殺傷活性、呼吸爆發(fā)活性、MPO和NO活性與對照組相比較都有明顯的差

9、異（P<0.05）。半滑舌鰨接種疫苗30d后的攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，受免魚免疫保護(hù)力可達(dá)71.4％。不難看出，通過上述利福平處理后篩選出來的的哈維氏弧菌減毒株具有作為活疫苗的潛能，可刺激半滑舌鰨魚體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答并產(chǎn)生較為顯著的免疫保護(hù)效果，可應(yīng)用于由該病原引起的半滑舌鰨細(xì)菌性疾病的免疫防控。
　　為了進(jìn)一步探討減毒活疫苗的制備方法，利用轉(zhuǎn)座子插入突變法篩選半滑舌鰨皮膚潰瘍性疾病病原減毒株。采用EZ-Tn5 In