塞來昔布對結(jié)腸癌裸鼠移植瘤中β-CATENIN、VEGF和微血管密度（MVD）的影響及機制研究.pdf

1、目的：通過建立結(jié)腸癌裸鼠種植瘤模型，給與COX-2抑制劑塞來昔布(Celecoxib)，檢測結(jié)腸癌裸鼠種植瘤中細胞Wnt信號通路中的樞紐分子β-連環(huán)素(β-catenin)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor.VEGF)的表達情況，檢測微血管密度(Microvessel density.MVD)；研究塞來昔布對結(jié)腸癌裸鼠種植瘤中β-連環(huán)素(β-catenin)、血管內(nèi)皮生長因子(VEG

2、F)及微血管密度(MVD)的影響。檢驗塞來昔布抗腫瘤效果，探討其抗腫瘤的部分機制，為將來臨床應用COX-2抑制劑提供前期準備工作。 方法：購買4～5周齡BALB/c雌性裸小鼠30只，體重20～24克，于無特定病原體(specified-pathogens free，SPF)環(huán)境下飼養(yǎng)，環(huán)境溫度、濕度適宜，無菌飼料及滅菌純凈水飼養(yǎng)。使用含10％新生牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的D/F12培養(yǎng)基，在37℃含5％

3、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞株HT-29。取處于對數(shù)生長期的HT29細胞，用培養(yǎng)基配置成細胞密度為1×107/ml的細胞懸液。裸鼠皮膚消毒后用1ml注射器在頸部右側(cè)皮下接種上述細胞懸液0.2ml建立種植瘤模型，定期觀察，游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)、短徑(b)，按公式V=ab2/2，計算腫瘤近似體積，16天后，腫瘤平均直徑達5mm，將裸小鼠隨機分為2組(塞來昔布組，對照組)，塞來昔布組給予塞來昔布混懸液40mg/kg/d，用小號灌胃針

4、灌胃給藥，對照組不予處理。給藥過程中注意抓持裸小鼠方法，固定小鼠，防治灌胃時小鼠掙扎，灌胃針損傷小鼠。 SPF環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)40天，每周測量小鼠的體重及腫瘤的體積，計算抑瘤率，給藥40天后，頸椎脫臼處死小鼠，切取種植瘤組織，部分置于4％多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)包埋切片，進行免疫組織化學檢測。部分置于液氮中凍存?zhèn)溆?。應用免疫組織化學方法觀察COX-2、β-catenin的表達情況；通過免疫組織化學方法檢測血管內(nèi)皮標志性因子CD34來觀察腫

5、瘤中的微血管密度。應用RT-PCR方法檢測腫瘤細胞中的VEGFmRNA的含量。各項指標均與對照組比較，應用SAS6.12統(tǒng)計軟件行t檢驗。在塞來昔布組中，應用直線相關分析方法，分析各指標間有無相關性。結(jié)果： 1、30只裸鼠均成瘤，成瘤率100％，成瘤時間為細胞種植后第5-11天。腫瘤細胞種植后第16天，腫瘤直徑平均達5mm。實驗結(jié)束切取瘤組織后，對裸鼠解剖未發(fā)現(xiàn)種植瘤肝轉(zhuǎn)移。 2、治療結(jié)束后，種植瘤體積分別為：對照組12

6、38±241mm3；塞來昔布組852±153mm3；塞來昔布能明顯抑制人結(jié)腸癌裸鼠種植瘤的生長。塞來昔布組抑瘤率為32.54％。t檢驗顯示，與對照組比較，塞來昔布組種植瘤生長緩慢(P＜0.05)。 3、COX-2陽性染色主要位于細胞胞漿，呈棕黃色彌漫性分布，對COX-2免疫組織化學染色切片進行積分光密度測定，與對照組比較，塞來昔布組COX-2表達明顯降低(P＜0.05)；β-catenin陽性染色主要位于細胞胞膜/漿，呈棕黃色顆

7、粒狀，對β-catenin免疫組織化學染色切片進行積分光密度測定，與對照組比較，塞來昔布組β-catenin表達明顯降低(P＜0.05)。 4、將RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，加入VEGF-mRNA引物的可見約178bp的擴增帶，加入GAPDH引物可見231bp的擴增帶，對兩條帶進行灰度分析發(fā)現(xiàn)，塞來昔布組VEGF-mRNA表達低于對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 5、免疫組織化學染色后對微血管熱區(qū)進行計數(shù)，塞來昔布組M

8、VD值較對照組降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 6、塞來昔布組內(nèi)指標比較顯示：COX-2與VEGF-mRNA和MVD之間成正相關關系(r＞0.9，P＜0.05)。β-catenin與VEGF-mRNA成正相關關系(r=0.95，P＜0.05)。 結(jié)論： 1、COX-2抑制劑塞來昔布明顯抑制結(jié)腸癌裸鼠種植瘤的生長。 2、通過抑制β-catenin的異常表達，減少經(jīng)Wnt信號傳導途徑引起的細胞增殖，抑