CD40信號(hào)復(fù)合體新組分的鑒定與功能初探.pdf

1、CD40分子是腫瘤壞死因子受體超家族的成員,不僅僅表達(dá)于正常的淋巴細(xì)胞中,而且在大多數(shù)的造血惡性腫瘤和上皮惡性腫瘤中也存在廣泛的表達(dá)。因?yàn)镃D40分子在免疫反應(yīng)中的中心地位,它在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中也扮演著非常中的作用。近年來許多證據(jù)甚至表明CD40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展中也有著重要作用。由于CD40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在自身免疫性疾病和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著非常重要的作用,已經(jīng)有一些針對(duì)CD40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物已經(jīng)處

2、于開發(fā)、研制狀態(tài)。因此通過各種研究技術(shù)和手段深入研究CD40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制,以期尋找疾病診斷的分子標(biāo)記物以及治療的藥物靶標(biāo)已成為目前研究的熱點(diǎn)。為了深入研究CD40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路涉及的大分子蛋白及其功能,本研究主要應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法,鑒定出CD40信號(hào)復(fù)合體中的新組分,并對(duì)新組分的功能進(jìn)行了初步探討。
　　本研究應(yīng)用基于內(nèi)源免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法對(duì)A20細(xì)胞(小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系)中CD40配體誘導(dǎo)形

3、成的CD40信號(hào)復(fù)合體作為樣品進(jìn)行分析。首先,將A20細(xì)胞用anti-CD40刺激10min或者不處理,然后每組分別用CD40抗體或IgG抗體進(jìn)行免疫沉淀,接著應(yīng)用SDS-PAGE對(duì)免疫沉淀復(fù)合物進(jìn)行分離,電泳后的凝膠用考馬斯亮藍(lán)染料進(jìn)行染色處理,確定差異蛋白質(zhì)的條帶。對(duì)一些差異蛋白條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶切,并通過高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測序,最后通過Mascot檢索軟件的MS/MS離子方式檢索數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)。通過檢索PUBMED文獻(xiàn)或其它

4、的數(shù)據(jù)庫,對(duì)鑒定的差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能進(jìn)行了解和分類,為進(jìn)一步深入研究這些差異蛋白的功能以及其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用打下了一定的基礎(chǔ)。同時(shí)對(duì)感興趣的差異的蛋白質(zhì)利用內(nèi)源免疫沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,并對(duì)其在信號(hào)功能中的作用進(jìn)行初步探索。
　　對(duì)電泳分離的免疫沉淀復(fù)合物用考馬斯亮藍(lán)染料染色處理之后,對(duì)30個(gè)差異蛋白條帶進(jìn)行了膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定,共鑒定出246個(gè)有意義的蛋白質(zhì),這些差異蛋白質(zhì)的功能分類如下:與細(xì)胞代謝相關(guān)的54個(gè),與細(xì)胞結(jié)構(gòu)

5、蛋白相關(guān)的11個(gè),與蛋白降解系統(tǒng)相關(guān)的12個(gè),與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的29個(gè),與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的55個(gè)。在這些蛋白質(zhì)中,有些與CD40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān),如:MAPKK1、JNK(stress-activated protein kinase,SAPK)、PI3K等;有些蛋白與細(xì)胞死亡相關(guān),如Dynactin。這些蛋白為研究CD40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其在疾病發(fā)生中的作用提供了重要線索,對(duì)差異的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞水平的驗(yàn)證以及在相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的具體作用

6、還需要進(jìn)一步更深入的研究。
　　細(xì)胞膜上的CD40分子與其配體結(jié)合后,可以使CD40分子之間交聯(lián)產(chǎn)生三聚化,進(jìn)而招募接頭蛋白TRAFs及NEMO,而TRAFs及NEMO的泛素化是CD40分子誘導(dǎo)的不同信號(hào)通路激活的重要事件,因而作為質(zhì)譜鑒定出的差異蛋白中與泛素相關(guān)的一些蛋白,如NEDD4、USP9X、E4B等就成為本研究的重要焦點(diǎn);而ROCKs是RhoA的直接下游靶蛋白,參與多種細(xì)胞功能,如平滑肌的收縮,細(xì)胞骨架的構(gòu)建,細(xì)胞的粘附

7、與運(yùn)動(dòng)等,且越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明ROCKs在發(fā)育過程及其它許多生理病病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,但是它發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不明確,所以質(zhì)譜鑒定出的差異蛋白R(shí)OCK1也稱為本研究的另一焦點(diǎn)。應(yīng)用體內(nèi)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)NEDD4、USP9X、E4B及ROCK1進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示出NEDD4及ROCK1均與CD40有相互作用,且這種相互作用不依賴于CD40配體的刺激;USP9X和E4B在本實(shí)驗(yàn)條件下沒有顯示出相互作用(結(jié)果未展示)。

8、　　NEDD4通過內(nèi)源免疫沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后,本研究又用外源共轉(zhuǎn)染NEDD4質(zhì)粒及NEMO、IKK?、IKKα、TRAF2、TRAF3等的質(zhì)粒進(jìn)行免疫共沉淀的方法,發(fā)現(xiàn)NEDD4與NEMO、TRAF3之間有相互作用,而與TRAF2無相互作用(TRAF2、TRAF3與NEDD4間的相互作用由本實(shí)驗(yàn)室方迪峰碩士完成),而且NEDD4能夠使NEMO、TRAF3發(fā)生泛素化(NEDD4對(duì)TRAF3的泛素化由本實(shí)驗(yàn)室方迪峰碩士完成)。接著為了探討NED

9、D4在通路中的作用,又構(gòu)建了慢病毒三質(zhì)粒載體系統(tǒng)用來建立NEDD4穩(wěn)定干涉的A20亞細(xì)胞系,但遺憾的發(fā)現(xiàn),由于慢病毒作用A20細(xì)胞后,引起細(xì)胞中CD40分子蛋白表達(dá)量上調(diào),使得此穩(wěn)定細(xì)胞系不適合用來進(jìn)行CD40信號(hào)通路的探討研究;為此我們又設(shè)計(jì)了針對(duì)NEDD4的特異siRNA對(duì)A20細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)干涉,接著用CD40配體去刺激細(xì)胞然后檢測通路變化,結(jié)果沒有檢測到明顯的變化;在NEDD4-/-的MEF細(xì)胞中TNF通路及EGF通路也沒有檢測到

10、明顯的變化。
　　為了進(jìn)一步研究ROCK1在CD40信號(hào)通路中的功能,本研究利用ROCK的抑制劑Y-27632預(yù)處理A20細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)添加了抑制劑Y-27632之后,CD40通路下游p-JNK的激活受到了一定程度的抑制。
　　本研究應(yīng)用高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定了246個(gè)可能的CD40信號(hào)復(fù)合體中新組分,并對(duì)差異蛋白NEDD4及ROCK1的功能進(jìn)行了初步研究,為以后深入研究CD40信號(hào)通路的分子機(jī)制和作用,以及為尋找疾病診