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1、目的:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)在多種腫瘤細(xì)胞中有異常表達(dá),與腫瘤的生長密切相關(guān),本實驗研究磷酸化ERK在肺癌細(xì)胞H460上的表達(dá)及對肺癌細(xì)胞生長的影響,探討其在激發(fā)型CD40單克隆抗體(5C11)抑制H460肺癌細(xì)胞增殖中的作用。 方法:以人肺癌細(xì)胞株H460為研究對象,以激發(fā)型CD40單克隆抗體(5C11)激發(fā)肺癌細(xì)胞中的CD40信號,采用四氮唑鹽(MTT)比色法檢測5C11、ERK上游激酶MEK1抑制劑PD98059單獨
2、應(yīng)用和兩者聯(lián)合應(yīng)用(PD98059預(yù)處理30min)時對肺癌細(xì)胞增殖的影響;免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)測定5C11及PD98059作用肺癌細(xì)胞后細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的改變情況以及5C11激發(fā)前后H460肺癌細(xì)胞上TNFR I、TNFR II的表達(dá)情況;Western Blot檢測CD40激發(fā)前后肺癌細(xì)胞中ERKl/2活性的變化,觀察應(yīng)用MEKl抑制劑PD98059阻斷ERK上游信號傳導(dǎo)后肺癌細(xì)胞中ERKl/2的活性。 結(jié)果:(1)激
3、發(fā)CD40分子可抑制表達(dá)CD40肺癌細(xì)胞H460的增殖,MEKl抑制劑PD98059同樣可抑制肺癌細(xì)胞的增殖(p<0.05),各濃度組間無顯著性差異(p>0.05),運(yùn)用PD98059預(yù)處理肺癌細(xì)胞30min后激發(fā)型CD40單克隆抗體對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用更明顯(p<0.05)。(2)激發(fā)CD40信號及應(yīng)用PD98059后均可引起肺癌細(xì)胞中G1/G0期細(xì)胞的增加(p<0.05),S期細(xì)胞的減少,兩者聯(lián)合使用阻滯于G1/G0期的細(xì)胞數(shù)較
4、5C11及PD98059單用時增加,但無統(tǒng)計學(xué)意義。(3)激發(fā)CD40信號及應(yīng)用PD98059作用肺癌細(xì)胞72h后檢測未見肺癌細(xì)胞的明顯凋亡(p>0.05),PD98059與激發(fā)型單抗聯(lián)合應(yīng)用時可部分誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(p<0.05)。 (4)表達(dá)CD40分子的肺癌細(xì)胞H460上可見有磷酸化ERK的表達(dá),激發(fā)型單抗5C11處理肺癌細(xì)胞5min后即可見ERK磷酸化活性的增強(qiáng),30min達(dá)最大值,4h后恢復(fù)至處理前水平,應(yīng)用MEKl抑制劑PD98
5、059處理細(xì)胞后可見細(xì)胞中磷酸化ERK水平的下降。(5)CD40信號激發(fā)后可見H460細(xì)胞表面TNFR I的上調(diào)(p<0.05)及TNFR II的下調(diào)(p<0.05)。 結(jié)論:激發(fā)C040信號可引起表達(dá)C040的肺癌細(xì)胞H460增殖抑制,同時該信號的活化可使肺癌細(xì)胞中ERK活性增強(qiáng),拮抗其抑制效應(yīng),使用ERK上游激酶MEK1抑制劑抑制ERK信號途徑可顯著提高激發(fā)型CD40單克隆抗體抑制H460細(xì)胞增殖的敏感性,提示細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)
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