家蠶類COP9信號復合體蛋白基因的研究.pdf

1、COP9信號復合體(Constitutiv.Photomorphogeni.signalosom.CSN)是近年來備受關注的保守蛋白復合體，含有八個亞單位，其中第五亞基CSN5/JAB1在各物種中保守性最高，且內嵌有CSN的功能位點-JAMM基序。CSN以其異構酶活性參與蛋白的泛素化降解途徑，調控細胞周期運轉及生物體的生長發(fā)育過程。在對本實驗室五齡幼蟲的cDNA庫進行檢索中，發(fā)現一條長度為1227bp的基因，預測其編碼的蛋白有349個氨

2、基酸殘基，相對分子量38 kDa，經NCBI比對發(fā)現，預測編碼的蛋白具有完整的JAB-MPN保守結構域，與COP9信號復合體具有較高的同源性，將其命名為BmJM。將此基因插入到融合表達載體pET-28a(+)的多克隆位點，經PCR，雙酶切鑒定重組質粒構建成功后，將重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta中，IPTG終濃度0 mM-.mM，25-37℃均表達成功，但表達的重組蛋白都以包涵體形式存在。經過溶解液洗滌，將含有目的蛋白的上清經鎳柱親和

3、層析和反相柱層析純化后，以純化的重組蛋白為抗原免疫大白兔獲得該蛋白的多克隆抗體，經ELISA檢測，抗體效價可達1：25600以上。提取家蠶各個時期和組織的天然蛋白和總RNA，利用熒光定量PCR技術以及熒光Wester.blotting技術，分析BmJM基因在家蠶發(fā)育過程中不同時期及五齡幼蟲各組織中的轉錄、表達情況。結果顯示該基因mRNA在家蠶發(fā)育各時期的表達量由高到低依次為蛾、蛹、幼蟲、卵，說明CSN伴隨著家蠶發(fā)育的完善，作用逐步顯現。