胃癌中CD40信號調節(jié)髓源性抑制細胞(MDSC)生物學功能的研究.pdf

1、胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，占消化道腫瘤的50％～60%，病死率居各類惡性腫瘤之首，5年生存率只有30%。近年來發(fā)病率明顯上升，而且越來越年輕化，但因早期癥狀不明顯，缺乏特異性的初篩指標，多數(shù)患者在就診時已經處于進展期，傳統(tǒng)根治手術及放化療對進展期胃癌的療效不理想。因此，迫切需要新的治療方法。免疫治療是目前的研究熱點，啟動和建立有效免疫應答正成為腫瘤治療的新希望。
　　目前眾多研究發(fā)現(xiàn)一些協(xié)同刺激分子在多種腫瘤中異常表達。CD

2、40/CD40L是介導特異性免疫應答的一對極其重要的共刺激分子。CD40表達于淋巴系統(tǒng)的惡性細胞，癌包括幾乎所有的B細胞惡性腫瘤，以及許多實體瘤，例如膀胱癌，腎癌，胰腺癌，胃，乳腺癌，大腸癌，肺癌等。臨床研究表明CD40的表達與腫瘤的進展和轉移有密切關聯(lián)。腫瘤細胞協(xié)同刺激分子的表達改變，包括正性協(xié)同刺激分子表達的下降或者突變，以及負性協(xié)同刺激分子的異常高表達，導致T細胞的凋亡及功能抑制，參與了腫瘤免疫逃逸。而腫瘤免疫逃逸通常與髓源性抑制

3、細胞（myeloid derived suppressorcell，MDSC）的聚集和調節(jié)性T細胞（Regulatory T cell，Treg）的增多相關。Treg在維持免疫耐受和破壞抗腫瘤反應中扮演重要角色。MDSC通過誘導活化的T細胞產生凋亡、釋放抑制性細胞因子、誘導Treg的產生以及與NK細胞和Treg細胞等形成復雜的網絡而產生負向調控功能。其抑制作用主要與精氨酸酶1(arginase-1，ARG1)和誘導型一氧化氮合酶(ind

4、ucible nitrieoxidesyntnase，iNos)有關。已有研究表明MDSC可通過抑制 T細胞免疫反應以及擴增 Treg發(fā)揮其免疫抑制功能的。
　　本研究以CD40為切入點，探討其對MDSC生物學功能的調控作用及相關機制，為認識MDSC在免疫逃逸中的作用提供有價值的線索。
　　第一部分：小鼠胃癌模型中MDSC上CD40的表達及其與腫瘤進展的關系
　　目的：檢測CD40分別在荷瘤小鼠脾臟來源和腫瘤浸潤的MD

5、SC上的表達水平，分析其表達在胃癌進展過程中可能的作用。
　　方法：利用小鼠胃癌細胞系 MFC皮下注射 C57BL/6j構建小鼠胃癌模型。隨著腫瘤進展，每隔5天脫頸處死3只模型鼠，剝離腫瘤和脾臟，通過流式細胞術檢測腫瘤不同進展階段脾臟及腫瘤浸潤組織中 MDSC比例及其表面 CD40表達情況，統(tǒng)計學分析其表達的意義。
　　結果：與正常小鼠脾臟MDSC相比，荷瘤小鼠脾臟來源的MDSC表面CD40的表達明顯上升（P=0.0024）

6、；脾臟MDSC以及腫瘤組織浸潤MDSC比例隨著腫瘤生長逐漸增高；MDSC上CD40表達水平隨腫瘤進展逐漸降低后穩(wěn)定至一定水平。此外，我們尚發(fā)現(xiàn)WildeType(WT)小鼠大約在5～6天成瘤，而CD40-/-小鼠約在7天后成瘤，腫瘤生長速度和大小明顯小于WT小鼠。隨著腫瘤進展，WT小鼠腫瘤浸潤性MDSC的累積水平明顯高于 CD40-/-小鼠。上述結果提示，在小鼠胃癌模型中，腫瘤相關MDSC表面共刺激分子CD40高表達，且與腫瘤進展相關。

7、
　　第二部分：探討CD40對MDSC生物學功能的調控作用
　　目的：以CD40分子為切入點，探討其在調節(jié)MDSC凋亡、對T細胞增殖抑制以及誘導Treg方面的調控作用及相關機制。
　　方法：自脾臟分離純化的Gr-1+CD11b+細胞調整細胞濃度鋪于24孔板。每孔加入2μl GM-CSF后，分別用IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、GM-CSF、IFN-γ、LPS、PEG2和MFC刺激24 h、48h、72h后，

8、收集細胞，用流式細胞術分別檢測CD40在MDSC上的表達。取經磁珠分選獲得的小鼠脾臟MDSC懸液，鋪入96孔板中，對照組加入PBS，實驗組加入激發(fā)型CD40抗體，5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h后，分別離心收集各孔細胞，流式細胞術分析 MDSC細胞凋亡率。將分選獲得的小鼠脾臟MDSC與CFSE染色T細胞按照1:3的比例，用anti-CD3和anti-CD28進行刺激，72小時后檢測CFSE熒光衰減，分析T細胞增殖情況。將WT小鼠和CD40K

9、O小鼠的脾臟細胞分離出來后，流式細胞術檢測IL-4，IL-17，IFN-γ，F(xiàn)oxp3的表達。
　　結果：LPS體外刺激MDSC后能夠上調表面分子CD40的表達，且在48小時后，CD40呈進一步顯著性上調。胃癌微環(huán)境下，CD40能夠顯著抑制MDSC的凋亡；而且CD40促進MDSC介導的抑制T細胞增殖功能；CD40參與了MDSC介導的Treg誘導-分化，促進Foxp3表達，增強MDSC免疫抑制功能，在胃癌免疫逃逸中發(fā)揮關鍵作用。

10、r>　　第三部分：Genechip分析CD40-/-與CD40low胃癌荷瘤小鼠脾臟細胞差異基因表達
　　目的：通過基因芯片技術分析CD40-/-與CD40low胃癌荷瘤小鼠脾臟細胞基因表達概況，尋找差異表達基因，分析CD40對MDSC生物功能作用的可能分子機制。
　　方法：參照第一部分構建胃癌荷瘤小鼠模型，當腫瘤直徑達1cm后，頸椎脫臼法處死WT荷瘤小鼠與CD40-/-荷瘤小鼠，手術取出完整的脾臟。經150目鋼網研磨，裂紅

11、后，加入1ml Trizol備用。Genechip委托北京博奧生物有限公司進行檢測。
　　結果：通過基因芯片技術對CD40-/-和WT小鼠脾臟細胞進行全基因組檢測，尋找差異表達基因，分析 CD40對 MDSC生物功能作用的可能分子機制。結果顯示兩組細胞基因表達譜有差異。篩選兩組間差異倍數(shù)（經log2轉換）2倍以上的基因為差異表達基因，篩選出2890個差異表達基因，其中表達上調593個，表達下調1419個。Pathway分析結果顯示