NEDD4在CD40信號(hào)通路中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、NEDD4(Neuronal precursor cell Expressed Developmentally Downregulated4，神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)基因4)蛋白質(zhì)屬于含HECT(Homologous to E6-APC-Terminus)結(jié)構(gòu)域的泛素E3酶，從酵母到人類高度保守，結(jié)構(gòu)上主要包括N末端的C2結(jié)構(gòu)域，2-4個(gè)WW結(jié)構(gòu)域和C末端的HECT結(jié)構(gòu)域，其底物往往含有PY模序(包括LPxY和PPxY)。NEDD4已

2、報(bào)道底物包括PTEN、Rap2A、Cbl-b、Gag和NEaC等，生物學(xué)功能涉及T細(xì)胞成熟、神經(jīng)發(fā)育、病毒出芽釋放和膜受體的降解與內(nèi)化等。本實(shí)驗(yàn)室前期工作應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定A20細(xì)胞中CD40信號(hào)復(fù)合物的新組分，其中包括NEDD4，而目前未有報(bào)道稱NEDD4直接參與CD40相關(guān)通路的調(diào)控。因此，本課題研究了NEDD4在CD40引起的下游通路激活過(guò)程中所起的作用以及機(jī)制。在HEK293和A20細(xì)胞中，通過(guò)免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)NEDD4能與C

3、D40通路的重要介導(dǎo)子TRAF3發(fā)生相互作用，但與TRAF2之間不存在相互作用，同時(shí)NEDD4能明顯促進(jìn)TRAF3的泛素化，而對(duì)TRAF2的泛素化則沒(méi)有影響，提示NEDD4可能是TRAF3的泛素E3酶。通過(guò)比較對(duì)照細(xì)胞和過(guò)表達(dá)NEDD4的A20細(xì)胞，對(duì)照細(xì)胞和NEDD4瞬時(shí)干涉的A20細(xì)胞以及對(duì)照細(xì)胞和NEDD4基因敲除的naive B淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NEDD4在一定程度上影響CD40信號(hào)通路下游蛋白質(zhì)p38的激活。由于NEDD4基因全身

4、敲除的小鼠胚胎致死，為了能得到NEDD4基因敲除的B淋巴細(xì)胞，我們通過(guò)胎肝移植的方法重建受體小鼠的免疫系統(tǒng)，成功得到了胎肝嵌合體。分離嵌合體小鼠的naive B淋巴細(xì)胞，通過(guò)PI染色和CFSE染色測(cè)定細(xì)胞的死亡和增殖，發(fā)現(xiàn)NEDD4對(duì)細(xì)胞的存活和增殖沒(méi)有影響。用CD43(Ly-48)MicroBeads負(fù)選naive B淋巴細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，NEDD4基因敲除的脾臟淋巴細(xì)胞中CD43陰性的細(xì)胞含量明顯增加。提示NEDD4在B細(xì)胞的發(fā)育及激活過(guò)