HP-PRRSV GP5蛋白在酵母中的高效分泌表達(dá)及抗體檢測(cè)iELISA方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的高度接觸性傳染病，給世界各國(guó)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。而高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)是PRRS經(jīng)典毒株的變異毒株，自2006年爆發(fā)以來(lái)，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成的損失更是毀滅性的。因此，建立快捷、敏感的診斷方法對(duì)提前預(yù)防該疾病，及時(shí)采取控制措施具有重要意義。GP5蛋

2、白作為PRRSV病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，成為血清學(xué)檢測(cè)的重要目標(biāo)蛋白。巴斯德畢赤酵母作為一種高效表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)，己被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效分泌表達(dá)去跨膜區(qū)的GP5(dGP5)蛋白，并基于該蛋白建立檢測(cè)GP5蛋白抗體的間接ELISA方法。
　　首先，本研究主要通過(guò)密碼子的偏嗜性、AT富含區(qū)、GC含量調(diào)整等對(duì)HP-PRRSV HuN4 GP5基因進(jìn)行優(yōu)化。在前期研究中，將編碼同樣氨基酸的HuN4野生型GP5

3、基因與優(yōu)化的GP5基因通過(guò)EcoRI和NotI雙酶切后，插入到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K中。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)SacI線性化后兩次電轉(zhuǎn)畢赤酵母菌株GS115中。經(jīng)過(guò)MD板和不同濃度的YPD-G418板篩選出PCR陽(yáng)性菌株，但發(fā)現(xiàn)蛋白均未在畢赤酵母中分泌表達(dá)。進(jìn)一步將dGP5基因進(jìn)行優(yōu)化并以同樣的方法在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，成功篩選到高效分泌表達(dá)的菌株。為摸索重組蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，從不同的方面對(duì)dGP5蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，如表

4、達(dá)時(shí)間、甲醇誘導(dǎo)濃度、pH值、溫度等。并通過(guò)SDS-PAGE和Western-blotting對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:優(yōu)化的dGP5基因在畢赤酵母中成功表達(dá)，經(jīng)過(guò)基因優(yōu)化后，氨基酸序列與優(yōu)化前一致，修改堿基75 bp，優(yōu)化后基因與原序列核苷酸同源性為76.9％，涉及62個(gè)氨基酸密碼子的改變，G+C含量由49.69％變?yōu)?2.28％。經(jīng)過(guò)外界誘導(dǎo)條件的優(yōu)化后，確定最佳誘導(dǎo)條件為轉(zhuǎn)速250 r/min，pH為6.5，溫度為24℃，甲醇誘導(dǎo)

5、濃度為1％，表達(dá)時(shí)間為120 h。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE和Western-blotting鑒定，目的帶大小為19KDa左右。
　　其次，通過(guò)His柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化并利用純化好的dGP5蛋白作為包被抗原，進(jìn)行間接ELISA方法的建立。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:抗原最佳包被濃度為0.21μg/孔，4℃過(guò)夜。血清最佳稀釋度為100倍，作用37℃1h。酶標(biāo)抗體進(jìn)行1∶40000倍稀釋?zhuān)饔?7℃1h。與PPV、RV、PRV、CSFV、和TEGV均無(wú)交叉