歐洲型與美洲型PRRSV特異N蛋白表位基因表達(dá)及ELISA抗體檢測方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的母豬繁殖障礙和仔豬呼吸困難為特征的一種病毒性傳染病。該病毒分為兩個(gè)型：歐洲型(以Lelystad Virus株為代表)和美洲型(以ATCC VR-2332株為代表)，兩者存在一定的抗原差異性。成功實(shí)現(xiàn)了美洲型與歐洲型PRRSV特異N蛋白抗原表位基因在大腸桿菌中的表達(dá)，并對重組蛋白進(jìn)行了純化，利用純化的重組蛋白初步建立了PRRSV抗體檢測間接ELISA方法。

2、 1.將針對美洲型與歐洲型PRRSV特異N蛋白抗原表位基因的重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-N與PQE30-N分別轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)與M15中，經(jīng)終濃度為1mmol/L的IPTG37℃誘導(dǎo)5h，分別高效表達(dá)了美洲型與歐洲型PRRSV特異N蛋白抗原表位區(qū)段即重組蛋白GST-N與HIS-N。western-Blot結(jié)果表明兩種蛋白可分別被美洲型和歐洲型PRRSV陽性血清所識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。 2.利用表達(dá)的重組融

3、合蛋白作為抗原，分別建立了檢測美洲型和歐洲型PRRSV抗體的間接ELIsA方法，確定了GST-N抗原的最適包被濃度為4.5ug/ml，最適包被條件為37℃1h 4℃過夜，以1％BSA作為封閉液，檢測血清稀釋度為1：40，HRP-兔抗豬IgG的最適工作濃度為1：1000；代檢血清與酶標(biāo)二抗均為37℃作用30min。確定陰陽性臨界值為0.43。初步組裝的試劑盒進(jìn)行現(xiàn)地血清的檢測應(yīng)用，與武漢科前ELIsA試劑盒的符合率達(dá)93.2％。HIS-N

4、抗原的最適包被濃度為8ug/ml，最適包被條件為37℃1h 4℃過夜，代檢血清按1：40稀釋，37℃作用60min。HRP-兔抗豬IgG的最適工作濃度為1：1000，37℃作用30min。包被的重組蛋白均不與豬瘟、豬偽狂犬病、豬日本乙型腦炎、豬圓環(huán)病毒的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，表明建立的ELISA診斷方法具有良好的特異性。美洲型和歐洲型PRRSV抗體檢測間接ELISA方法的建立為我國進(jìn)行PRRS抗體的監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速簡便的