HP-pRRSV抑制IFn-β表達(dá)及其調(diào)控機(jī)理的研究.pdf

1、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(Highly Pathogenetic Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV)是PRRSV經(jīng)過突變形成的具有更強(qiáng)致病性的毒株，能夠引起豬的高熱癥狀，懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等繁殖障礙，新生仔豬和育肥豬出現(xiàn)呼吸道疾病且生長緩慢。病毒或細(xì)菌等病原微生物與巨噬細(xì)胞表面的受體結(jié)合以后，與受體發(fā)生相互作用，并刺激巨噬細(xì)胞等分泌Ⅰ型干擾

2、素(interferon，IFN)和抗病毒細(xì)胞因子，其中IFN-beta(IFN-β)是在病毒感染過程中具有重要作用的Ⅰ型IFN的成員之一。但是某些病毒或細(xì)菌被巨噬細(xì)胞吞噬后不僅不被降解，反而抑制宿主分泌IFN-β等天然免疫應(yīng)答反應(yīng)，在巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中感染和增殖，HP-PRRSV就是典型的代表。HP-PRRSV感染抑制宿主的Ⅰ型IFN介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)，例如抑制IFN-β的表達(dá)，然而HP-PRRSV對宿主的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)的抑制

3、（如IFN-β的表達(dá)）及其機(jī)理還不十分清楚。
　　本文主要是通過分析MARC-145和豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolarmacrophages，PAM)免疫調(diào)控通路RIG-Ⅰ中重要基因IRF3、CBP等在HP-PRRSV感染前后表達(dá)水平及其定位等特征，探討PRRSV受體基因變異對PRRSV感染的影響，研究HP-PRRSV抑制宿主的IFN-β表達(dá)的機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　(1) HP-PRRSV感染抑制MARC

4、-145細(xì)胞中的IFN-β的mRNA表達(dá)水平。感染(+HP-PRRSV)的MARC-145細(xì)胞中的IFN-β的表達(dá)量在檢測的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1hpi,12 hpi,24 hpi,36 hpi,48 hpi)均低于非感染的對照組(-HP-PRRSV)細(xì)胞的表達(dá)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)感染(+HP-PRRSV)和非感染的對照組（-HP-PRRSV）中的IFN-β的表達(dá)量非常微弱，無法有效的反映其變化趨勢和不利于后期研究。為了更有效地開展研究，利用常用的IF

5、N的刺激劑Poly(I∶C)處理MARC-145細(xì)胞后，IFN-β的表達(dá)量顯著增加。然而，Poly(I∶C)刺激和提高的IFN-β的表達(dá)水平同樣被HP-PRRSV顯著抑制，而且在MARC-145細(xì)胞(Poly(I∶C)+HP-PRRSV)中IFN-β的表達(dá)量變化趨勢與感染的(+HP-PRRSV) MARC-145細(xì)胞中的相似。因此，采用Poly(I∶C)處理的MARC-145細(xì)胞作為對照組，Poly(I∶C)和HP-PRRSV處理的MA

6、RC-145細(xì)胞作為試驗(yàn)組開展后續(xù)研究。試驗(yàn)組(Poly(I∶C)+HP-PRRSV）MARC-145細(xì)胞的IFN-β的表達(dá)量顯著低于對照組(Poly(I∶C))。因此后期的試驗(yàn)側(cè)重于研究HP-PRRSV對IFN-β表達(dá)的抑制機(jī)理。
　　(2) HP-PRRSV感染抑制MARC-145細(xì)胞中的IFN-β蛋白表達(dá)量。檢測了試驗(yàn)組(Poly(I∶C)+HP-PRRSV)和對照組(Poly(I∶C))MARC-145細(xì)胞的IFN-β的蛋

7、白表達(dá)量，結(jié)果和(1)中的IFN-β的mRNA表達(dá)量的趨勢一致。
　　(3) HP-PRRSV感染抑制肺泡巨噬細(xì)胞(PAM) IFN-β的mRNA和蛋白表達(dá)。進(jìn)一步檢測試驗(yàn)組和對照組PRRSV自然感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞PAM(Porcinealveolar macrophages)的IFN-β表達(dá)，PAM細(xì)胞中IFN-β的mRNA和蛋白表達(dá)趨勢一致，而且PAM與MARC-145細(xì)胞的結(jié)果一致。
　　(4) HP-PRRSV感染

8、抑制IFN-β的重要調(diào)控因子IRF3的表達(dá)。在MARC-145細(xì)胞與PAM細(xì)胞中，分別檢測了試驗(yàn)組和對照組的IRF3的mRNA、總蛋白的表達(dá)量，試驗(yàn)組的表達(dá)量均低于對照組，而且IRF3的mRNA、總蛋白的表達(dá)的趨勢一致。
　　(5)HP-PRRSV感染抑制IRF3的核轉(zhuǎn)位。在MARC-145細(xì)胞與PAM細(xì)胞中，進(jìn)一步檢測了試驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的IRF3的表達(dá)量。結(jié)果表明，試驗(yàn)組的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的IRF3都分別低于對照組，

9、而且試驗(yàn)組細(xì)胞核的IRF3蛋白非常少以致無法檢測。推測HP-PRRSV感染能夠減少IRF3由胞質(zhì)向核轉(zhuǎn)移的數(shù)量。
　　(6)HP-PRRSV感染抑制IRF3的磷酸化。在MARC-145細(xì)胞與PAM細(xì)胞中，檢測了試驗(yàn)組和對照組的IRF3的磷酸化蛋白的表達(dá)量，試驗(yàn)組的表達(dá)量均低于對照組。推測HP-PRRSV感染通過抑制IRF3蛋白的磷酸化來抑制IRF3的核轉(zhuǎn)位。
　　(7)HP-PRRSV感染抑制IRF3蛋白Ser396位點(diǎn)的磷

10、酸化。生物信息學(xué)對IRF3的蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測表明，Ser396隱蔽在IRF3蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)和卷曲結(jié)構(gòu)的交界處，而且已經(jīng)有研究表明該位點(diǎn)對IRF3磷酸化具有重要作用，因此推測HP-PRRSV感染通過抑制Ser396位點(diǎn)暴露來抑制IRF3磷酸化。
　　(8) HP-PRRSV感染對環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CBP)表達(dá)沒有顯著影響。IRF3進(jìn)入細(xì)胞核通過與CBP結(jié)合形成復(fù)合物才能與IFN-β的啟動子結(jié)合，促進(jìn)IFN-β表達(dá)。MAR

11、C-145細(xì)胞與PAM細(xì)胞中的感染試驗(yàn)組和對照組的CBP的mRNA表達(dá)量均沒有明顯差異，推測HP-PRRSV感染對CBP的表達(dá)沒有顯著影響。
　　(9) PAM細(xì)胞膜的PRRSV受體基因變異對HP-PRRSV感染的風(fēng)險(xiǎn)具有重要影響。HP-PRRSV感染的風(fēng)險(xiǎn)性與CD163和CD169的單核苷酸突變(SNP)相關(guān)。HP-PRRSV被細(xì)胞表面的受體識別并吞噬后才能進(jìn)入細(xì)胞，CD163和CD169是兩種重要的受體。Logistic回歸方

12、法對524頭豬（康復(fù)豬n=298，患病豬n=95，死亡豬n=41，健康豬n=90）共6個(gè)SNPs的基因型進(jìn)行感染風(fēng)險(xiǎn)分析，共得到3種基因型與HP-PRRSV感染相關(guān)，包括CD169-C1654A的AA基因型、CD169-C4175T的CT基因型、CD163-A2552G的AA基因型，比其它的基因型感染HP-PRRSV的風(fēng)險(xiǎn)小一些。說明具有吞噬功能的CD163和CD169的SNPs與感染HP-PRRSV的風(fēng)險(xiǎn)性有關(guān)。
　　(10)受

13、體CD169和CD163基因的單核苷酸突變影響受體介導(dǎo)的吞噬功能。蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測軟件分析結(jié)果表明，CD169受體的3個(gè)SNPs均能導(dǎo)致氨基酸的改變，而且都位于免疫球蛋白區(qū)域，影響蛋白穩(wěn)定性。這3個(gè)SNPs通過改變蛋白穩(wěn)定性來影響受體介導(dǎo)的吞噬功能。CDI63受體的2個(gè)SNPs位于結(jié)合病原體的結(jié)構(gòu)域，雖然不改變氨基酸，但是通過影響密碼子的偏好性進(jìn)而改變翻譯的蛋白的數(shù)量。另一個(gè)SNP也位于結(jié)合病原體的結(jié)構(gòu)域，通過改變氨基酸影響受體的吞噬

14、功能。
　　本研究初步認(rèn)為HP-PRRSV通過影響IRF3二級和三級結(jié)構(gòu)而降低了IRF3的磷酸化水平，IRF3蛋白的較低磷酸化水平影響和降低了IRF3進(jìn)入細(xì)胞核的數(shù)量，減少了蛋白IRF3和CBP結(jié)合形成的復(fù)合物，并且減少了復(fù)合物與IFN-β啟動子結(jié)合機(jī)會，從而抑制IFN-β的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，進(jìn)而使HP-PRRSV抑制了宿主的免疫反應(yīng)而感染侵害宿主。此外，PAM細(xì)胞膜上的PPRSV受體基因（CD163和CD169）的變異和不同基因型