抗PRRSV--GP5蛋白豬源抗體基因的克隆、表達(dá).pdf

1、豬繁殖與呼吸障礙綜合征(PRRS)，是世界范圍內(nèi)威脅養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一，主要引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸系統(tǒng)疾病。雖然各國在防控PRRS方面投入了巨大財(cái)力，但并未消除PRRSV在全世界范圍內(nèi)的流行與傳播。傳統(tǒng)的快速診斷PRRSV抗原或抗體的方法包括逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)診斷技術(shù)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。但RT-PCR技術(shù)的高靈敏度會導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，而商品化的ELISA診斷試劑盒價(jià)格昂貴，因此，尋找特異性

2、高而又價(jià)格低廉的診斷PRRS的方法勢在必行。近幾年來，隨著DNA重組技術(shù)以及蛋白質(zhì)工程技術(shù)日趨成熟，基因工程抗體被大規(guī)模生產(chǎn)以應(yīng)用于臨床疾病的診斷。重組抗體具有制備時(shí)間短，生產(chǎn)成本低，便于改造，而且能特異性識別病原微生物等優(yōu)點(diǎn)，在動物疾?。ㄈ鏟RRS）的鑒別和診斷方面具有廣闊前景。
　　為制備與PRRSV具有反應(yīng)活性的豬源化重組抗體(PrAb)，在本實(shí)驗(yàn)中，我們以PRRSV疫苗對巴馬豬進(jìn)行免疫，待在豬體內(nèi)檢測到抗PRRSV-GP5

3、抗體后，對其進(jìn)行剖殺，采集外周血，分離外周血淋巴細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)，以含保守表位的多肽及抗豬IgG抗體，篩選出能夠與PRRSV抗原表位結(jié)合的來自同一克隆的陽性B細(xì)胞，利用RT-PCR從B細(xì)胞中擴(kuò)增編碼抗體重鏈可變區(qū)(VH)基因序列和輕鏈可變區(qū)(VL)基因序列，將擴(kuò)增的可VH和VL分別與實(shí)驗(yàn)室保存的豬源抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)(CH)基因序列連接后，以Linker序列將輕鏈和重鏈全長基因序列相連，構(gòu)建全長的豬源抗體編碼基因（H

4、-linker-I）。將該連接產(chǎn)物克隆至載體pET-28a中，酶切鑒定及測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)，并對表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。利用蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)對表達(dá)出的目的蛋白種屬進(jìn)行鑒定，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)鑒定目的蛋白與PRRSV的反應(yīng)活性。WB結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白與抗豬IgG抗體結(jié)合呈陽性反應(yīng)，而與抗鼠IgG呈陰性反應(yīng)，表明表達(dá)的重組蛋白為PrAb;經(jīng)ELISA

5、鑒定，PrAb與PRRSV弱毒株CH1R和強(qiáng)毒株HuN4呈陽性反應(yīng)，表明所制備的PrAb為PRRSV特異性抗體。
　　本實(shí)驗(yàn)中，我們建立了利用保守抗原表位及抗B細(xì)胞表面抗原抗體篩選來自同一克隆特異性B細(xì)胞的方法，成功擴(kuò)增出豬源抗體的VH和VL編碼序列，并構(gòu)建了豬源重組抗體原核表達(dá)載體，成功表達(dá)出了能和PRRSV特異性結(jié)合的豬源重組抗體，為利用B細(xì)胞法制備抗其他病原微生物抗體提供了借鑒，獲得了能和PRRSV特異性結(jié)合的重組抗體，為用