miR-146a在胃癌中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　研究microRNA-146a(miR-146a)在胃癌中的作用，并探討與其作用相關(guān)的靶基因。
　　方法:
　　qRT-PCR檢測(cè)60例胃癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織miR-146a的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;同時(shí)，qRT-PCR檢測(cè)人胃癌細(xì)胞株MKN-45、SGC-7901、MGC-803和HGC-27 miR-146a的表達(dá)情況。運(yùn)用慢病毒顆粒過(guò)表達(dá)MKN-45和SGC-7901細(xì)胞中miR-

2、146a水平，干擾MGC-803和HGC-27細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)。CCK-8法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察miR-146a對(duì)胃癌細(xì)胞株增殖的影響;劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和鋪或不鋪Matrigel的transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-146a對(duì)胃癌細(xì)胞株遷移、侵襲能力的作用;裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-146a對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移能力的作用;利用靶基因預(yù)測(cè)軟件并結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)探討miR-146a與轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因;qRT-

3、PCR法和Western blot法檢測(cè)miR-146a作用于靶基因的機(jī)制;在過(guò)表達(dá)miR-146a的胃癌細(xì)胞株基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染不含3'UTR的WASF2（上述驗(yàn)證的miR-146a與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因）編碼區(qū)，在miR-146a inhibitor處理的胃癌細(xì)胞株基礎(chǔ)上干擾WASF2，探討miR-146a對(duì)胃癌的作用是否通過(guò)靶基因WASF2介導(dǎo);免疫組化法檢測(cè)60例胃癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織WASF2的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)

4、性;分析60例胃癌組織中miR-146a與WASF2水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.miR-146a在胃癌組織中表達(dá)下降。在本實(shí)驗(yàn)的60例胃癌及相應(yīng)癌旁組織中，miR-146a的相對(duì)中位表達(dá)水平分別為0.162±0.019和0.823±0.072，P＜0.01，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.miR-146a在胃癌中的表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，miR-146a表達(dá)越低，胃癌患者的TNM分期越晚，

5、P=0.018; miR-146a表達(dá)越高，胃癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率越低，P＜0.001。
　　3.miR-146a在胃癌細(xì)胞系MKN-45和SGC-7901中表達(dá)較低，在MGC-803和HGC-27細(xì)胞中表達(dá)較高，過(guò)表達(dá)MKN-45和SGC-7901細(xì)胞中miR-146a水平，干擾MGC-803和HGC-27細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)，用于后續(xù)的細(xì)胞生物學(xué)行為研究。
　　4.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞OD值結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)

6、和干擾miR-146a對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)和干擾miR-146a胃癌細(xì)胞克隆形成率無(wú)明顯差異，miR-146a對(duì)胃癌細(xì)胞群體依賴性和增殖能力無(wú)影響。
　　5.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示miR-146a可降低胃癌細(xì)胞的遷移能力，轉(zhuǎn)染miR-146a的MKN-45和SGC-7901細(xì)胞24h后劃痕仍有相當(dāng)?shù)木嚯x，而對(duì)照組劃痕有明顯的變窄。不鋪matrigel的tranwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)

7、果顯示，MKN-45和SGC-7901細(xì)胞miR-146a過(guò)表達(dá)組24h后Transwell小室每視野細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少，P值分別為P=0.0037和P＜0.0001;MGC-803和HGC-27細(xì)胞miR-146a干擾組24h后Transwell小室每視野細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多，P值分別為P＜0.0001和P=0.0039。進(jìn)一步提示miR-146a可抑制胃癌細(xì)胞遷移能力。
　　6.鋪matrigel的tranwell小室實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)果表明，miR-146a可降低胃癌細(xì)胞的侵襲能力。MKN-45和SGC-7901細(xì)胞miR-146a過(guò)表達(dá)組24h后Transwell小室每視野細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少，P值分別為P=0.0007和P＜0.0001;MGC-803和HGC-27細(xì)胞miR-146a干擾組24h后Transwell小室每視野細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多，P值分別為P=0.0045和P=0.0015。
　　7.裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下mi

9、R-146a過(guò)表達(dá)組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目明顯減少，全肺間斷抽樣切片20張每張切片平均肺轉(zhuǎn)移病灶miR-146a過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組分別為8±2 vs20±3，P=0.0182。
　　8.靶基因預(yù)測(cè)軟件結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果驗(yàn)證了WASF2是miR-146a腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因，miR-146a降低WASF23'UTR克隆載體psiCHECK2相對(duì)熒光值達(dá)45％。
　　9.qRT-PCR和Western blot檢測(cè)miR-146

10、a過(guò)表達(dá)和干擾胃癌細(xì)胞株WASF2mRNA和蛋白水平結(jié)果表明，miR-146a作用于靶基因WASF2的機(jī)制是抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯。
　　10.回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)WASF2可逆轉(zhuǎn)miR-146a對(duì)MKN-45細(xì)胞遷移侵襲能力的抑制作用;反之，干擾WASF2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-146a inhibitor促M(fèi)KN-45細(xì)胞遷移侵襲能力。
　　11.免疫組化檢測(cè)60例胃癌及相應(yīng)癌旁組織WASF2水平表明，WASF2在胃癌組織中高表

11、達(dá)，癌組織和癌旁組織表達(dá)差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001;且胃癌組織WASF2的表達(dá)水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，WASF2表達(dá)越高，胃癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率越高，P=0.013。
　　12.分析胃癌組織中miR-146a與WASF2水平相關(guān)性結(jié)果顯示，WASF2低表達(dá)組miR-146a中位水平為0.227±0.035;WASF2高表達(dá)組miR-146a中位水平為0.118±0.017，胃癌組織中miR-146a表達(dá)水平與WA