葛根素抑制酒精誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化.pdf

1、研究背景；長期大量的酒精攝入可以導(dǎo)致酒精性骨病，包括酒精性骨質(zhì)疏松、酒精性骨壞死等。隨著世界酒精飲品消耗量的增加，酒精性骨病的發(fā)病率逐年增加，對(duì)人群健康造成極大危害。具體發(fā)病機(jī)制還不清楚。有研究表明，酒精可以通過上調(diào)體外培養(yǎng)小鼠、大鼠和人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymal stem cells；MSCs)的過氧化物酶增殖物活化受體γ2(The peroxisomalproliferator-activated

2、 receptor γ2；PPAR-γ2)的基因表達(dá)，促進(jìn)MSCs成脂分化，抑制其成骨分化，進(jìn)而導(dǎo)致酒精性骨病的發(fā)生。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，異黃酮類物質(zhì)能夠下調(diào)PPAR-γ2的基因表達(dá)，抑制地塞米松誘導(dǎo)的MSCs向脂肪細(xì)胞分化。 目的；從細(xì)胞分子生物學(xué)角度研究葛根素是否對(duì)酒精導(dǎo)致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells；hMSCs)成脂分化具有抑制作用，探討葛根素對(duì)酒精性骨

3、病的防治可能性。 方法 1 hMSCs分離與培養(yǎng)骨髓標(biāo)本取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科自愿受試的男性病人。所有受試者均無骨代謝性疾病。每位自愿者抽取骨髓8ml。采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液梯度離心法進(jìn)行分離，獲得原代hMSCs后，接種于含15％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 2實(shí)驗(yàn)分組取傳代細(xì)胞，隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、模型組(細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)每日加酒精0.09 mol/L)、實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)每日加入酒精

4、1次，0.09mol/L；每3日向細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入葛根素1次，10×10<'-6>mol/L)。 3 ALP的檢測分組后，分別采用酒精、葛根素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。干預(yù)10d，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測細(xì)胞內(nèi)ALP活性。 4脂肪細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)干預(yù)21d，采用油紅“O”法進(jìn)行脂肪細(xì)胞染色，并在光鏡下計(jì)數(shù)每cm2細(xì)胞爬片上脂肪細(xì)胞數(shù)量。 5基因表達(dá)的檢測實(shí)驗(yàn)干預(yù)7d，采用RT-PCR兩步法檢測各組細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ2的基因表達(dá)情況。

5、 結(jié)果 1 hMSCs的體外培養(yǎng)形態(tài)特點(diǎn)經(jīng)梯度離心法分離獲取hMSCs后，原代細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)約4 h開始貼壁，呈圓形的未伸展?fàn)顟B(tài)； 4 d左右細(xì)胞大部分貼壁，向外周伸展，呈飽滿梭形，類似典型的成纖維細(xì)胞樣。10d左右細(xì)胞數(shù)量顯著增加，多數(shù)聚集形成小集落樣生長，細(xì)胞沿一定方向排列。12～16d形成大小不等的集落。細(xì)胞多已覆蓋瓶底達(dá)80％以上可進(jìn)行細(xì)胞傳代。 2細(xì)胞內(nèi)ALP活性分組干預(yù)10d，測得細(xì)胞內(nèi)．ALP活性模

6、型組中最低為(27.0±10.3 U/100mg蛋白)，顯著低于對(duì)照組(39.6±8.7 U/100rag蛋白)和實(shí)驗(yàn)組(40.2±10.1 U/100mg蛋白)(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組稍低于對(duì)照組，二者差異無顯著性(P>0.05)。 3脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)干預(yù)21d，模型組脂肪細(xì)胞數(shù)最多，達(dá)383+37/cm<'2>，而且圓形細(xì)胞比例較實(shí)驗(yàn)組多，細(xì)胞內(nèi)脂滴大而豐富。實(shí)驗(yàn)組脂肪細(xì)胞數(shù)約1984-38個(gè)/cm<'2>較模型組內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)顯

7、著減少(P<0.05)，對(duì)照組脂肪細(xì)胞出現(xiàn)極少僅約7±6個(gè)/cm<'2>。 4基因表達(dá)干預(yù)7d，模型組細(xì)胞的PPAR吖2基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的PPAR-72基因表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)，稍高于對(duì)照組，但二者間差異無顯著性(P>0.05)。 結(jié)論 1酒精具有導(dǎo)致hMSCs成脂分化的作用。 2葛根素能下調(diào)PPAR-γ2基因表達(dá)水平。抑制酒精導(dǎo)致的骨髓間充質(zhì)干細(xì)