棉花枯萎病菌拮抗菌的篩選和抑菌機(jī)理初探.pdf

1、目的：本研究從烏拉爾甘草、阿魏和苦豆子中篩選出拮抗棉花枯萎病菌的內(nèi)生菌，初步分離拮抗菌A的抑菌物質(zhì)，探究抑菌機(jī)理，并研究拮抗菌對(duì)棉花生長(zhǎng)的影響。
　　方法：拮抗菌的分離和篩選采用平板培養(yǎng)法，生長(zhǎng)曲線、最適pH、糖發(fā)酵、淀粉水解試驗(yàn)及革蘭氏染色對(duì)拮抗菌的基本性質(zhì)進(jìn)行了研究；通過(guò)16SrDNA序列比對(duì)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。超聲波破碎細(xì)胞，離心分離胞內(nèi)、胞外分泌物，硫酸銨沉淀透析法分離胞內(nèi)抑菌粗蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250法檢測(cè)蛋白濃度，Sep

2、hadex G-75柱層析初步純化抑菌蛋白，SDS-PAGE法測(cè)定抑菌蛋白分子量大小。抑菌物質(zhì)對(duì)棉花枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)分生孢子和分生孢子萌發(fā)的影響分別采用平板培養(yǎng)法、顯微計(jì)數(shù)法、凹玻片培養(yǎng)法。檢測(cè)了拮抗菌A處理棉花種子后，其萌發(fā)率和成株率的變化，以及棉苗在不同生長(zhǎng)時(shí)期的POD、PPO、PAL活性。
　　結(jié)果：⑴從烏拉爾甘草、阿魏和苦豆子中分離并篩選得到了4株對(duì)棉花枯萎病菌具有拮抗性的內(nèi)生菌，其中拮抗菌A抑菌效果最好，初篩抑菌圈直

3、徑達(dá)26.96mm。經(jīng)過(guò)鑒定，拮抗菌A、B、C、D分別屬于Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus tequilensis、Bacillus sp.、Klebsiella pneumoniae。⑵拮抗菌A的胞內(nèi)分泌物對(duì)棉花枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)分生孢子和分生分生孢子萌發(fā)的抑制率均大于胞外分泌物。其中對(duì)棉花枯萎病菌產(chǎn)分生孢子的抑制效果最好，平均抑制率為40.14％，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的拮抗菌對(duì)產(chǎn)分生孢子的抑制率最大，為

4、88.81%。⑶濃度為80%的硫酸銨沉淀出的蛋白對(duì)棉花枯萎病菌的抑制率最大(19.55%)。分離的粗蛋白保持抑菌活性的最高耐受溫度為60℃，最高耐受pH為8，最低耐受pH為4。⑷抑菌粗蛋白經(jīng)過(guò)Sephadex G-75柱層析分離，在200-400s之間收集的洗脫液對(duì)棉花枯萎病菌產(chǎn)分生孢子的抑制率達(dá)34.79%，均大于其對(duì)菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的抑制率。初步分離得到的抑菌蛋白分子量在25 kDa-100 kDa之間。⑸拮抗菌A處理棉花種子

5、后可提高其成株率。棉花苗期不同生長(zhǎng)時(shí)期的POD、PPO、PAL酶活性測(cè)定結(jié)果表明，接種棉花枯萎病菌后，用拮抗菌A處理過(guò)的棉花植株在播種40d后PAL酶活性顯著增加；此外，同一生長(zhǎng)時(shí)期、不同處理的棉苗3種酶活性均無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論：本研究從烏拉爾甘草、阿魏和苦豆子中分離并篩選得到了4株對(duì)棉花枯萎病菌抑制作用較好的內(nèi)生菌，初步探究了拮抗菌A的抑菌機(jī)理；拮抗菌A抑菌物質(zhì)產(chǎn)生于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胞內(nèi)分泌物抑菌效果較好，主要抑制途徑為抑制棉花