豬1型圓環(huán)病毒杭州分離株的全基因組克隆及其主要功能蛋白相互作用的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus,PCV)最初被認(rèn)為是豬。腎傳代細(xì)胞系PK15的一種非致病性污染物。目前已知PCV分為兩個(gè)血清型:PCV1和PCV2,兩者都屬于圓環(huán)病毒屬。斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)于1991年首先發(fā)現(xiàn)于加拿大西部,給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2是引起PMWS的主要病原微生物之一,而與之遺傳相

2、關(guān)的PCV1雖然廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)但卻被認(rèn)為不能對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生致病性。本研究通過(guò)PCR方法克隆到1株P(guān)CV1杭州分離株的全基因組,并在此基礎(chǔ)上對(duì)其主要功能蛋白的相互作用進(jìn)行了研究,主要研究結(jié)果如下:
　　 將疑似PMWS病豬淋巴結(jié)、脾臟、肝臟等器官的組織樣品經(jīng)液氮速凍后,研磨粉碎,用蛋白酶K法提取基因組DNA。根據(jù)已發(fā)表的PCVI序列(GenBank登錄號(hào):U49186)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增PCVl的全基因組,并將其克隆入pGEM-T

3、easy載體進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明這株P(guān)CV1基因組的全長(zhǎng)為1759bp,與GenBank中發(fā)表的其它30株P(guān)CV1相比,基因組同源性為98.6％～99.8％;與60株P(guān)CV2相比,同源性僅為76.8％～78.0％。將其命名為HZ2006,登錄GenBank,登錄號(hào)為:EF533941。
　　 對(duì)GenBank中迄今發(fā)表的全部31株P(guān)CV1、部分PCV2(60株)以及其它10株圓環(huán)病毒科病毒進(jìn)行生物信息學(xué)分析。PCVs間親緣關(guān)系

4、分析結(jié)果表明:PCV1與PCV2在很大程度上來(lái)自于同一個(gè)祖先;PCV1株間遺傳與分子進(jìn)化分析結(jié)果表明:PCV1可分為基因Ⅰ型與基因Ⅱ型兩種基因型;PCV1與PCV2之間基因組結(jié)構(gòu)和功能區(qū)分析結(jié)果表明:PCVs基因組之間在復(fù)制起始區(qū)等功能區(qū)高度保守,在主要的編碼區(qū),尤其是編碼cap蛋白的ORF2,存在不少差異。
　　 設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增PCV1-cap、PCV1-rep以及PCV2-cap的基因片段。分別將它們克隆入酵母雙雜交載體

5、pGADT7和pGBKT7中,構(gòu)建“prey”載體pGADT7-PCV1-cap、pGADT7-PCV1-rep和pGADT7-PCV2-cap以及“bait”載體pGBKT7-PCV1-cap。應(yīng)用醋酸鋰的方法將“prey”載體轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中,在SD/-Leu選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng);將“bait”載體轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中,在SD/-Trp選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。將“prey”載體pGADT7-PCV1-cap、pGADT7-PC

6、V1-rep和pGADT7-PCV2-cap分別與空“bait”載體pGBKT7以及“bait”載體pGBKT7-PCV1-cap與空“prey”載體pGADT7共同轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞,在SD/-Trp-Leu-Ade-His選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果表明:所構(gòu)建的4個(gè)重組質(zhì)粒均可以在酵母細(xì)胞體內(nèi)表達(dá),對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性作用,亦無(wú)自身激活活性,可以作為酵母雙雜交體系中的“prey”載體和“bait”載體,用于雙雜交實(shí)驗(yàn),檢測(cè)蛋白-蛋白之間的相互作用

7、。
　　 將構(gòu)建好的“Bait”質(zhì)粒pGBKT7-PCV1-cap轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞AH109中。用含有“Bait”質(zhì)粒的酵母細(xì)胞制備感受態(tài),然后分別將“Prey”質(zhì)粒pGADT7-PCV1-cap、pGADT7-PCV1-rep、pGADT7-PCV2-cap轉(zhuǎn)入含有“Bait”質(zhì)粒的酵母細(xì)胞AH109中。雙雜交實(shí)驗(yàn)和β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)證實(shí)在酵母體內(nèi)pGBKT7-PCV1-cap與pGADT7-PCV1-rep、pGBKT7-P