鵝圓環(huán)病毒浙江株全基因組克隆及其外殼蛋白的原核表達(dá).pdf

1、鵝圓環(huán)病毒(Goose Circovirus，GoCV)是近年來發(fā)現(xiàn)的圓環(huán)病毒科的一個(gè)新成員。與其他圓環(huán)病毒一樣，鵝圓環(huán)病毒常潛伏感染，但往往侵染淋巴細(xì)胞等增殖速度快的細(xì)胞，引起免疫力下降，導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)多種條件性病原二次感染的易感性增加。
　　 根據(jù)已發(fā)表的鵝圓環(huán)病毒序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)檢測引物，對(duì)浙江永康禽流感病死鵝樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期552 bp大小相符的DNA片段，經(jīng)測序、BlastN比對(duì)確認(rèn)為GoCV特異序列，推測樣

2、品中存在GoCV。根據(jù)測定的序列進(jìn)一步設(shè)計(jì)反向擴(kuò)增引物，經(jīng)擴(kuò)增、測序、拼接后獲得GoCV全長基因組序列。
　　 基因組序列分析表明，浙江永康株GoCV—yk01全長1821bp，具有圓環(huán)病毒共同的與病毒復(fù)制相關(guān)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和Rep蛋白保守基序等特征，它與德國、中國臺(tái)灣發(fā)表的序列在全基因組水平有91％～93％的同源性，在Rep和外殼蛋白的氨基酸水平有94％～97％的同源性。應(yīng)用ClustalW方法作進(jìn)化樹分析顯示，GoCV—yk01

3、序列與德國株及中國臺(tái)灣株均不在同一分支。
　　 設(shè)計(jì)一對(duì)引物，將去除了N端部分序列的外殼蛋白(ΔCap蛋白)基因克隆到原核表達(dá)載體pET—28a的His標(biāo)簽下游，進(jìn)行His—ΔCap融合蛋白表達(dá)。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，SDS—PAGE檢測出與預(yù)期大小(27.6 kDa)相符的目的蛋白，通過BandScan軟件分析，重組ΔCap融合蛋白的表達(dá)量為18.3％，Western blot分析表明ΔCap蛋白能與His單抗特異反應(yīng)。將ΔCa

4、p蛋白用鎳瓊脂糖凝膠純化、復(fù)性后測得其純度為78.5％。用差速離心法從GoCV陽性群鵝法氏囊組織中提取GoCV病毒并將其與弗氏佐劑乳化后免疫家兔，制備了兔抗GoCV多克隆抗體，經(jīng)瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測效價(jià)為1：16。用表達(dá)的重組ΔCap蛋白包被酶標(biāo)板，用兔抗GoCV多抗和鵝血清中的GoCV抗體競爭該抗原，初步建立了檢測鵝血清GoCV抗體的間接競爭ELISA法。試驗(yàn)表明該方法的最佳抗原包被濃度為8.9μg/ml；兔抗GoCV抗體的稀釋度為1：400