骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在胰腺損傷和慢性炎癥中的作用及MicroRNA在CP-PDAC大鼠模型中的表達和意義.pdf

1、研究目的:
　　1.探討 BMSCs在胰腺損傷修復(fù)中的作用.
　　2.探討 BMSCs在慢性胰腺炎纖維化中的作用.
　　3.探討 MicroRNA是否可以作為 CP-PDAC過程中標(biāo)志物.
　　研究方法:
　　1.建立 C57/BL6小鼠胰腺損傷模型(65％～70％胰腺部分切除),通過尾靜脈注射表達綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)的小鼠BMSCs(GFP+ BMS

2、Cs的表面標(biāo)志用流式細(xì)胞術(shù)檢測,成脂和成骨分化能力用相應(yīng)的成脂和成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)檢測),應(yīng)用GFP免疫組織化學(xué)技術(shù)分析 BMSCs在損傷胰腺中的遷移與分布;運用胰腺導(dǎo)管上皮標(biāo)志 CK-19,胰島β細(xì)胞標(biāo)志 Insulin,胰腺星狀細(xì)胞標(biāo)志 Desmin和α-SMA,血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志 CD31和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志 Nestin與 GFP免疫熒光雙染激光共聚焦成像技術(shù)分析胰腺組織中BMSCs的表型,并統(tǒng)計 GFP+/CK19+, GFP+/In

3、sulin+, GFP+/Desmin+, GFP+/α-SMA+, GFP+/CD31+, GFP+/Nestin+亞群所占比例;用電子秤稱量手術(shù)四周后的小鼠體重和胰腺重量,計算胰腺/體重比;將四周后的小鼠胰腺消化為單細(xì)胞懸液,用流式細(xì)胞術(shù)分選出 GFP+的細(xì)胞。用實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)檢測分選出的GFP+的細(xì)胞,野生型(Wild type)BMSCs和GFP+ BMSCs中4種 MicroRNA(miR-9, miR

4、-204, miR-375和miR-34a)的表達。接受 GFP+ BMSCs注射的正常小鼠和不接受 GFP+ BMSCs注射的胰腺損傷小鼠作為對照。
　　2.建立 C57/BL6小鼠慢性胰腺炎模型(蛙皮素誘導(dǎo)8周),通過尾靜脈注射 GFP+小鼠BMSCs(表面標(biāo)志和成脂成骨能力檢測同前),應(yīng)用GFP免疫組織化學(xué)技術(shù)分析 BMSCs在纖維化胰腺中的遷移與分布;運用胰腺星狀細(xì)胞標(biāo)志 Desmin和α-SMA,MMP-2和MMP-9與

5、 GFP免疫熒光雙染激光共聚焦成像技術(shù)分析胰腺組織中BMSCs的表型,并統(tǒng)計 GFP+/CK19+, GFP+/Insulin+, GFP+/Desmin+,GFP+/α-SMA+, GFP+/CD31+亞群所占比例;用天狼星紅(Sirius red)染色和Image Pro Plus軟件檢測胰腺組織的纖維化程度;用Western blotting技術(shù)檢測胰腺組織中MMP-9和MMP-2的表達水平。不接受 GFP+ BMSCs注射的慢性

6、胰腺炎胰腺小鼠作為對照。
　　3.建立大鼠慢性胰腺炎-胰腺癌(CP-PDAC)模型:將大鼠胰膽管部分結(jié)扎(75％),8周內(nèi)形成慢性胰腺炎,然后在大鼠胰腺內(nèi)包埋二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenzanthracene, DMBA)粉末,三個月內(nèi)形成胰腺癌。只包埋 DMBA的大鼠作為對照組。在不同時間點取大鼠模型的胰腺標(biāo)本,用qRT-PCR檢測不同病變程度胰腺中相關(guān) MicroRNA(miR-34a, miR-204, m

7、iR-107和miR-21)的表達,比較 MicroRNA在正常胰腺,不同程度纖維化胰腺,PanINs病變和PDAC中的表達差異。
　　實驗結(jié)果:
　　1.免疫組化的結(jié)果顯示 GFP廣泛表達于損傷胰腺的實質(zhì)和間質(zhì)中,其中導(dǎo)管結(jié)構(gòu)中有18.5±3.3％,血管結(jié)構(gòu)中有23.4±5.6％,腺泡結(jié)構(gòu)中有3.4±1.5％,胰島結(jié)構(gòu)中沒有,其它間質(zhì)中有54.7±8.9％。免疫熒光雙染共聚焦技術(shù)顯示 GFP+ BMSCs分化為胰腺導(dǎo)管上皮

8、細(xì)胞(占1.7±0.3％),胰腺星狀細(xì)胞(占5.2±1.6％),血管內(nèi)皮細(xì)胞(占3.2±0.6％),沒有發(fā)現(xiàn)其分化為胰島細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。損傷胰腺中的GFP+BMSCs和其分化的細(xì)胞遠多于正常胰腺。對于部分切除胰腺的小鼠,接受 GFP+BMSCs注射的小鼠的胰腺重量/體重比((0.225±0.042)％)高于未接受 GFP+BMSCs注射的小鼠((0.183±0.021)％)(p<0.05)。另外,實時定量 PCR的結(jié)果顯示 miR-9和

9、miR-204在定植于胰腺的BMSCs中的表達高于野生型 BMSCs和GFP+BMSCs(分別為5.2-fold和2.6-fold, p<0.05)。miR-375在定植于胰腺的BMSCs中表達降低(0.71-fold, p<0.05),而miR-34a的表達沒有明顯改變。
　　2.HE染色顯示蛙皮素處理8周后出現(xiàn)典型慢性胰腺炎特征,免疫組化的結(jié)果顯示GFP廣泛表達于纖維化胰腺的實質(zhì)和間質(zhì)中,免疫熒光雙染共聚焦技術(shù)顯示 GFP+B

10、MSCs分化為胰腺星狀細(xì)胞(GFP+/Desmin+和GFP+/α-SMA+)(占7.5±2.3％),部分 GFP+ BMSCs表達 MMP-2和MMP-9。Image Pro Plus軟件檢測天狼星紅染色的胰腺切片,發(fā)現(xiàn)接受 GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎小鼠的纖維化面積占4.56％+0.63％,小于未接受 GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎小鼠(7.37％+0.92％,P<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示

11、接受 BMSCs處理的胰腺組織中MMP-2和MMP-9的表達高于未接受 BMSCs處理的胰腺組織。
　　3.實時熒光定量 PCR結(jié)果顯示:相對于慢性胰腺炎大鼠胰腺,miR-34a在 PanIN-1, PanIN-2, PanIN-3和PDAC病變組織中表達顯著升高(p<0.05),miR-204在PanIN-2, PanIN-3和PDAC病變組織中表達顯著降低(p<0.05),miR-21在 PanIN-3和PDAC病變組織中表達

12、顯著升高(p<0.05),而miR-107只在 PDAC病變組織中表達升高(p<0.05)。
　　實驗結(jié)論:
　　1.外周血中的BMSCs能遷移到損傷的胰腺中,并能通過分化為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞和胰腺星狀細(xì)胞參與胰腺的損傷修復(fù),促進胰腺再生。miR-9, miR-204和miR-375可能參與 BMSCs在胰腺中的分化過程。
　　2.外周血中的BMSCs能遷移到纖維化的胰腺中,能通過表達 MMP-2和MMP-9降