骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在輸尿管不全梗阻大鼠腎臟中的分化.pdf

1、目的:
　　 梗阻性腎病(obstructive nephropathy,ON)是泌尿外科常見(jiàn)疾病,以腎小管間質(zhì)纖維化為主要病理特點(diǎn)。兒童梗阻性腎病最終可導(dǎo)致終末期腎臟疾病(end-stage renal disease ESRD),梗阻性腎病占所有ESRD的0.3％,占所有兒童腎移植的16.1％。在人類(lèi)梗阻性腎病中,多數(shù)為不全性梗阻。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有自我增殖和多向分化潛能的特點(diǎn),可向中胚層、內(nèi)胚

2、層和神經(jīng)外胚層來(lái)源的組織細(xì)胞分化,包括成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和腎臟細(xì)胞等,有研究表明骨髓MSCs在急性腎臟損傷小鼠模型中可以促進(jìn)腎臟結(jié)構(gòu)修復(fù)、改善腎功能。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是促進(jìn)成體干細(xì)胞向腎臟細(xì)胞分化的候選因子,還具有阻止腎小管細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外分離、培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增大鼠骨髓MSCs,并建立單側(cè)輸尿管不全梗阻(partial unilateral ureter obstruction PUU

3、O)大鼠動(dòng)物模型,將Ad-HGF和MSCs共同移植入解除梗阻的PUUO大鼠體內(nèi),觀察MSCs是否能夠遷移、分布、定居到腎臟,并分化為相應(yīng)的腎臟細(xì)胞,以及.Ad-HGF對(duì)MSCs的影響,為梗阻性腎病的基因治療及細(xì)胞替代治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　 材料與方法:
　　 MSCs細(xì)胞培養(yǎng)與純化:體外分離、培養(yǎng)雄性SD大鼠MSCs,流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD34、CD90表型鑒定;以不同強(qiáng)度攜帶綠色熒光蛋白的重組腺病毒(Ad-GFP)

4、轉(zhuǎn)染MSCs,用流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染效率,篩選出最佳轉(zhuǎn)染強(qiáng)度(MOI),并以最佳轉(zhuǎn)染強(qiáng)度將Ad-GFP基因體外轉(zhuǎn)染MSCs。
　　 PUUO大鼠模型制作:成年健康雌性SD大鼠(260g±20g)(30只),按照對(duì)左腎輸尿管上段處置方式不同隨機(jī)分成5組,正常對(duì)照組(6只);腰大肌包埋組(6只);套管壓迫組(6只);絲線結(jié)扎組(6只);浸液體石蠟油的絲線結(jié)扎組(6只)。分別于梗阻后3d、1W、2W各取2只,大體觀察同時(shí)行IVP檢查,確

5、定輸尿管梗阻情況。
　　 MSCs細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及分化:選擇成年健康雌性SD大鼠(260g±20g)32只,制作PUUO大鼠動(dòng)物模型,隨機(jī)分為對(duì)照組(A)和實(shí)驗(yàn)(B、C)。PUUO術(shù)后7天解除梗阻,并同時(shí)在解除梗阻側(cè)腎臟實(shí)質(zhì)多點(diǎn)注射,A組單純注射生理鹽水:B組注射綠色熒光蛋白標(biāo)記的MSCs:C組注射MSCs與Ad-HGF的混合物。于注射術(shù)后7天、14天分別處死移植組及對(duì)照組大鼠,取雙側(cè)腎臟,制作石蠟切片,利用免疫熒光雙標(biāo)方法檢測(cè)MS

6、Cs在PUUO大鼠腎臟中的分布及分化情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、骨髓MSCs原代培養(yǎng)7-9天可傳代,傳代后細(xì)胞增殖加快,4-5天可再次傳代;流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示骨髓MSCs中CD90陽(yáng)性細(xì)胞占99％,不表達(dá)CD34。
　　 2、轉(zhuǎn)染強(qiáng)度MOI=400時(shí),轉(zhuǎn)染效率可達(dá)85.91％。
　　 3、浸石蠟油的絲線結(jié)扎組模型用彈簧秤控制力度(0.25kg),使模型的均一性得到控制;用IVP檢查確定模型組為輸尿

7、管不完全梗阻。
　　 4、免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明:在PUUO大鼠解除輸尿管梗阻術(shù)后7天、14天梗阻側(cè)腎臟均可見(jiàn)Ad-GFP陽(yáng)性細(xì)胞,Ad-HGF和MSCs共同移植組與單純MSCs移植組相比,Ad-GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、貼壁細(xì)胞分離法可以分離、純化大鼠MSCs。
　　 2、彈簧秤控制結(jié)扎力度(0.25 kg)下,浸石蠟油的絲線輸尿管結(jié)扎法是一種理想的PUUO