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文檔簡介
1、脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是嚴重的中樞神經(jīng)損傷,致死、致殘率高,嚴重危害人民健康,給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟和精神負擔。長期以來,脊髓損傷的治療作為全球醫(yī)學界尚未解決的重大難題之一,仍然缺少實質(zhì)性改善受損脊髓功能的治療手段。現(xiàn)有的臨床治療手段主要是早期應用大劑量激素及手術治療等,但是對于脊髓損傷的治療效果均不佳。近年來,移植外源性干細胞促進脊髓損傷修復成為目前的研究熱點。 骨髓間充質(zhì)干細胞(Mese
2、nchymal stem cells,MSCs)是一種成體干細胞,具有自我更新及多向分化潛能,移植入體內(nèi)后能夠分化為神經(jīng)元樣細胞替代死亡的神經(jīng)細胞,建立神經(jīng)通路或分泌營養(yǎng)因子,挽救損傷神經(jīng),促進軸突再生等發(fā)揮作用。且具有易于獲取、來源豐富、沒有明顯移植排斥反應、易于轉(zhuǎn)染外源基因等優(yōu)點,在治療脊髓損傷方面有很好的應用前景。然而,干細胞移植入體內(nèi)后遷移和分布的機制仍不明確。 為追蹤干細胞移植后體內(nèi)的遷移和分布,以往的試驗大多采用病理
3、學手段,以GFP、Brdu等標記移植細胞后移植到損傷脊髓內(nèi),在多時間點處死動物取組織切片,用免疫組化、免疫熒光的方法來檢測移植細胞。但是以上方法需要在不同時間點處死實驗動物以獲取觀察材料,所以無法在同一活體動物體內(nèi)連續(xù)多時間點的觀察移植細胞的遷移、分布及分化情況,在科研與臨床研究中存在許多限制。分子影像學(molecular imaging,MI)是分子生物學與現(xiàn)代醫(yī)學影像技術相結(jié)合的產(chǎn)物,是一門新興的邊緣學科。1999年美國哈佛大學W
4、eissleder等人首先提出分子影像學的概念,即應用影像學方法,對活體狀態(tài)下體內(nèi)分子的生物化學過程進行定性和定量研究。磁性標記作為分子影像學技術中較有優(yōu)勢的一種,是將磁性對比劑轉(zhuǎn)入干細胞后移植入體內(nèi),借助磁共振成像(MRI)顯示標記的細胞,能夠在活體特異性的連續(xù)追蹤移植細胞,具有良好的組織分辨率、無創(chuàng)傷、無電離輻射等優(yōu)點;并且可以很方便的應用相關軟件經(jīng)過三維重建來反映干細胞分布的全貌,十分適合追蹤干細胞在體內(nèi)的遷移和分布。 目
5、前MSCs移植修復脊髓損傷的途徑主要有:原位、蛛網(wǎng)膜下腔和靜脈三條,主要以原位注射為主。磁性標記干細胞體內(nèi)示蹤較多采用的是鐵標記(SPIO),該標記方法在T2上的圖像會受到出血的影響,原位注射過程導致的出血是無法完全避免的,這影響了鐵標記在脊髓損傷原位移植細胞的示蹤中的應用。而釓(Gd)標記為T1正性信號,不會受到出血等于擾因素的影響,但目前釓標記與鐵標記相比,分辨率低下是其主要問題。蛛網(wǎng)膜下腔注射與原位移植相比,損傷小,遷移到損傷部位
6、的干細胞又遠遠高于靜脈移植,是有應用前景的移植方法,目前對于蛛網(wǎng)膜下腔注射的MSCs是如何遷移到脊髓損傷部位的了解仍很少。 本課題組在前期研究中構(gòu)建了大鼠脊髓損傷模型,建立了一整套分離培養(yǎng)BMSCs的方法,將MSCs移植到大鼠脊髓損傷原位,改善了損傷的神經(jīng)功能,以免疫組化、免疫熒光等方法觀察到了移植細胞的存活和分化。本研究在前期工作的基礎上,結(jié)合分子影像學的最新進展,針對脊髓損傷中不同移植方式的特點,分別采用Gd和Fe標記損傷原
7、位和蛛網(wǎng)膜下腔移植的MSCs,以3TMRI和小動物線圈追蹤移植細胞在體內(nèi)的遷移和分布,并與GFP標記的病理結(jié)果、功能評分的改善等相驗證,全面客觀的評價移植細胞在脊髓損傷模型中的遷移和分布。 本研究包括以下二個部分: 第一部分:釓標記骨髓間充質(zhì)干細胞在脊髓損傷原位移植后的示蹤研究 方法:實驗分為體外、體內(nèi)兩部分。體外部分:以Jetpei、魚精蛋白轉(zhuǎn)染試劑標記MSCs,在MRI下檢測標記細胞的信號強度;以掃描電鏡確認
8、標記的Gd顆粒在細胞內(nèi)的分布;以MTT、臺盼藍、多向誘導分化實驗檢測標記后對細胞增殖、分化等生物學活性的影響。體內(nèi)部分:制作大鼠脊髓損傷模型,觀察其在MR下的圖像特點;移植未標記的MSCs,觀察MR下信號的改變;移植GFP、Gd-DTPA/Jetpei標記的MSCs,連續(xù)觀察移植后1、3、7、14天的MRI圖像,并在相應時間點取材切片,以免疫熒光驗證MRI上的發(fā)現(xiàn)。以BBB評分評價Gd—DTPA標記的MSCs、未標記的MSCs對運動功能
9、恢復的影響。 結(jié)果:體外部分:Gd—DTPA/Jetpei能夠高效標記MSCs,標記效果(信號強度)遠高于魚精蛋白和單純的Gd—DTPA;電鏡顯示標記后Gd顆粒位于胞膜和胞漿中;Gd標記不影響MSCs的增殖和多向分化。體內(nèi)部分:大鼠脊髓損傷模型以水腫表現(xiàn)為主,在MRI上呈T2高信號,原位移植未標記細胞以出血表現(xiàn)為主,在MRI上呈T2低信號,均不影響T1信號。Gd標記的MSCs在MRI上呈T1高信號,可連續(xù)觀察到至少14天,相應時
10、間點取材切片的病理結(jié)果(免疫熒光)與MRI相符合,移植細胞3天時主要位于注射原位,后逐漸分布到整個損傷節(jié)段,但又不超出損傷節(jié)段。Gd標記的MSCs也可明顯促進脊髓損傷運動功能的恢復,與未標記的MSCs相比無明顯差異。 結(jié)論:以Jetpei轉(zhuǎn)染Gd—DTPA入MSCs,是高效低毒的T1正性標記方法,適合原位移植MSCs的體內(nèi)示蹤和其它有出血因素存在情況下的移植細胞的示蹤。 第二部分:鐵標記骨髓間充質(zhì)干細胞在脊髓損傷蛛網(wǎng)膜下
11、腔移植后的示蹤研究 方法:用攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒(AD5/F35-EGFP)和SPIO標記分離純化后的MSCs,免疫熒光和普魯士蘭染色顯示標記效果。制作大鼠脊髓損傷模型,并進行蛛網(wǎng)膜下腔置管成功的10只SD大鼠,隨機分為2組,將標記細胞(實驗組,n=5)和未標記細胞(對照組,n=5)經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植入模型鼠。在移植前、移植后3天、7天、14天用3TMRI對移植細胞進行活體示蹤,并與損傷脊髓組織切片GFP表達對照。 結(jié)
12、果:AD5/F35-EGFP和SPIO可以高效標記MSCs,標記細胞表達綠色熒光,普魯士蘭染色顯示MSCs胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍色鐵顆粒,標記對細胞增殖活力沒有明顯的影響。蛛網(wǎng)膜下腔移植標記細胞到大鼠脊髓損傷模型,可以在MRI下觀察到損傷區(qū)域逐漸增強的T2低信號,組織切片熒光的發(fā)現(xiàn)與MRI結(jié)果一致,提示蛛網(wǎng)膜下腔移植的MSCs可以遷移到脊髓損傷局部。未標記細胞組MRI下無明顯低信號改變。 結(jié)論:SPIO納米顆??梢杂行擞汳SCs,蛛網(wǎng)膜
13、下腔移植的MSCs可以遷移到脊髓損傷區(qū)域,利用MRI可以對移植細胞進行活體示蹤。 實驗總結(jié) 本研究結(jié)論如下: 1.Gd—DTPA/Jetpei能有效標記MSCs,標記不影響細胞的生物學活性 2.SPIO能有效標記MSCs,標記不影響細胞的生物學活性 3.MSCs原位注射和經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射移植到大鼠脊髓損傷模型后均可以在損傷區(qū)分布和存活,并促進功能恢復。 4.Gd—DTPA標記引起T1高信號
14、,適用于體內(nèi)動態(tài)追蹤原位移植的MSCs;SPIO標記引起T2低信號,適用于體內(nèi)動態(tài)追蹤蛛網(wǎng)膜下腔移植的MSCs。 MSCs通過不同途徑移植入大鼠脊髓損傷模型中后可以遷移到損傷區(qū)域存活并發(fā)揮功能,磁性標記體內(nèi)示蹤可以全面、客觀評價移植細胞的遷移與分布。本實驗根據(jù)不同移植途徑的具體需要,分別選用臨床常用的Gd類造影劑Magnevist和SPIO類造影劑Resovist轉(zhuǎn)染MSCs,所得資料可為揭示MSCs修復脊髓損傷的機制提供實驗
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