磁性標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠脊髓損傷模型中示蹤的研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是嚴(yán)重的中樞神經(jīng)損傷，致死、致殘率高，嚴(yán)重危害人民健康，給家庭和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。長期以來，脊髓損傷的治療作為全球醫(yī)學(xué)界尚未解決的重大難題之一，仍然缺少實(shí)質(zhì)性改善受損脊髓功能的治療手段。現(xiàn)有的臨床治療手段主要是早期應(yīng)用大劑量激素及手術(shù)治療等，但是對于脊髓損傷的治療效果均不佳。近年來，移植外源性干細(xì)胞促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)成為目前的研究熱點(diǎn)。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mese

2、nchymal stem cells，MSCs)是一種成體干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能，移植入體內(nèi)后能夠分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞替代死亡的神經(jīng)細(xì)胞，建立神經(jīng)通路或分泌營養(yǎng)因子，挽救損傷神經(jīng)，促進(jìn)軸突再生等發(fā)揮作用。且具有易于獲取、來源豐富、沒有明顯移植排斥反應(yīng)、易于轉(zhuǎn)染外源基因等優(yōu)點(diǎn)，在治療脊髓損傷方面有很好的應(yīng)用前景。然而，干細(xì)胞移植入體內(nèi)后遷移和分布的機(jī)制仍不明確。 為追蹤干細(xì)胞移植后體內(nèi)的遷移和分布，以往的試驗(yàn)大多采用病理

3、學(xué)手段，以GFP、Brdu等標(biāo)記移植細(xì)胞后移植到損傷脊髓內(nèi)，在多時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物取組織切片，用免疫組化、免疫熒光的方法來檢測移植細(xì)胞。但是以上方法需要在不同時(shí)間點(diǎn)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲取觀察材料，所以無法在同一活體動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)多時(shí)間點(diǎn)的觀察移植細(xì)胞的遷移、分布及分化情況，在科研與臨床研究中存在許多限制。分子影像學(xué)(molecular imaging，MI)是分子生物學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是一門新興的邊緣學(xué)科。1999年美國哈佛大學(xué)W

4、eissleder等人首先提出分子影像學(xué)的概念，即應(yīng)用影像學(xué)方法，對活體狀態(tài)下體內(nèi)分子的生物化學(xué)過程進(jìn)行定性和定量研究。磁性標(biāo)記作為分子影像學(xué)技術(shù)中較有優(yōu)勢的一種，是將磁性對比劑轉(zhuǎn)入干細(xì)胞后移植入體內(nèi)，借助磁共振成像(MRI)顯示標(biāo)記的細(xì)胞，能夠在活體特異性的連續(xù)追蹤移植細(xì)胞，具有良好的組織分辨率、無創(chuàng)傷、無電離輻射等優(yōu)點(diǎn)；并且可以很方便的應(yīng)用相關(guān)軟件經(jīng)過三維重建來反映干細(xì)胞分布的全貌，十分適合追蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移和分布。 目

5、前MSCs移植修復(fù)脊髓損傷的途徑主要有：原位、蛛網(wǎng)膜下腔和靜脈三條，主要以原位注射為主。磁性標(biāo)記干細(xì)胞體內(nèi)示蹤較多采用的是鐵標(biāo)記(SPIO)，該標(biāo)記方法在T2上的圖像會(huì)受到出血的影響，原位注射過程導(dǎo)致的出血是無法完全避免的，這影響了鐵標(biāo)記在脊髓損傷原位移植細(xì)胞的示蹤中的應(yīng)用。而釓(Gd)標(biāo)記為T1正性信號(hào)，不會(huì)受到出血等于擾因素的影響，但目前釓標(biāo)記與鐵標(biāo)記相比，分辨率低下是其主要問題。蛛網(wǎng)膜下腔注射與原位移植相比，損傷小，遷移到損傷部位

6、的干細(xì)胞又遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于靜脈移植，是有應(yīng)用前景的移植方法，目前對于蛛網(wǎng)膜下腔注射的MSCs是如何遷移到脊髓損傷部位的了解仍很少。 本課題組在前期研究中構(gòu)建了大鼠脊髓損傷模型，建立了一整套分離培養(yǎng)BMSCs的方法，將MSCs移植到大鼠脊髓損傷原位，改善了損傷的神經(jīng)功能，以免疫組化、免疫熒光等方法觀察到了移植細(xì)胞的存活和分化。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子影像學(xué)的最新進(jìn)展，針對脊髓損傷中不同移植方式的特點(diǎn)，分別采用Gd和Fe標(biāo)記損傷原

7、位和蛛網(wǎng)膜下腔移植的MSCs，以3TMRI和小動(dòng)物線圈追蹤移植細(xì)胞在體內(nèi)的遷移和分布，并與GFP標(biāo)記的病理結(jié)果、功能評分的改善等相驗(yàn)證，全面客觀的評價(jià)移植細(xì)胞在脊髓損傷模型中的遷移和分布。 本研究包括以下二個(gè)部分： 第一部分：釓標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脊髓損傷原位移植后的示蹤研究 方法：實(shí)驗(yàn)分為體外、體內(nèi)兩部分。體外部分：以Jetpei、魚精蛋白轉(zhuǎn)染試劑標(biāo)記MSCs，在MRI下檢測標(biāo)記細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度；以掃描電鏡確認(rèn)

8、標(biāo)記的Gd顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布；以MTT、臺(tái)盼藍(lán)、多向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)檢測標(biāo)記后對細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)活性的影響。體內(nèi)部分：制作大鼠脊髓損傷模型，觀察其在MR下的圖像特點(diǎn)；移植未標(biāo)記的MSCs，觀察MR下信號(hào)的改變；移植GFP、Gd-DTPA/Jetpei標(biāo)記的MSCs，連續(xù)觀察移植后1、3、7、14天的MRI圖像，并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材切片，以免疫熒光驗(yàn)證MRI上的發(fā)現(xiàn)。以BBB評分評價(jià)Gd—DTPA標(biāo)記的MSCs、未標(biāo)記的MSCs對運(yùn)動(dòng)功能

9、恢復(fù)的影響。 結(jié)果：體外部分：Gd—DTPA/Jetpei能夠高效標(biāo)記MSCs，標(biāo)記效果(信號(hào)強(qiáng)度)遠(yuǎn)高于魚精蛋白和單純的Gd—DTPA；電鏡顯示標(biāo)記后Gd顆粒位于胞膜和胞漿中；Gd標(biāo)記不影響MSCs的增殖和多向分化。體內(nèi)部分：大鼠脊髓損傷模型以水腫表現(xiàn)為主，在MRI上呈T2高信號(hào)，原位移植未標(biāo)記細(xì)胞以出血表現(xiàn)為主，在MRI上呈T2低信號(hào)，均不影響T1信號(hào)。Gd標(biāo)記的MSCs在MRI上呈T1高信號(hào)，可連續(xù)觀察到至少14天，相應(yīng)時(shí)

10、間點(diǎn)取材切片的病理結(jié)果(免疫熒光)與MRI相符合，移植細(xì)胞3天時(shí)主要位于注射原位，后逐漸分布到整個(gè)損傷節(jié)段，但又不超出損傷節(jié)段。Gd標(biāo)記的MSCs也可明顯促進(jìn)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，與未標(biāo)記的MSCs相比無明顯差異。 結(jié)論：以Jetpei轉(zhuǎn)染Gd—DTPA入MSCs，是高效低毒的T1正性標(biāo)記方法，適合原位移植MSCs的體內(nèi)示蹤和其它有出血因素存在情況下的移植細(xì)胞的示蹤。 第二部分：鐵標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脊髓損傷蛛網(wǎng)膜下

11、腔移植后的示蹤研究 方法：用攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒(AD5/F35-EGFP)和SPIO標(biāo)記分離純化后的MSCs，免疫熒光和普魯士蘭染色顯示標(biāo)記效果。制作大鼠脊髓損傷模型，并進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔置管成功的10只SD大鼠，隨機(jī)分為2組，將標(biāo)記細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組，n＝5)和未標(biāo)記細(xì)胞(對照組，n＝5)經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植入模型鼠。在移植前、移植后3天、7天、14天用3TMRI對移植細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤，并與損傷脊髓組織切片GFP表達(dá)對照。 結(jié)

12、果：AD5/F35-EGFP和SPIO可以高效標(biāo)記MSCs，標(biāo)記細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，普魯士蘭染色顯示MSCs胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色鐵顆粒，標(biāo)記對細(xì)胞增殖活力沒有明顯的影響。蛛網(wǎng)膜下腔移植標(biāo)記細(xì)胞到大鼠脊髓損傷模型，可以在MRI下觀察到損傷區(qū)域逐漸增強(qiáng)的T2低信號(hào)，組織切片熒光的發(fā)現(xiàn)與MRI結(jié)果一致，提示蛛網(wǎng)膜下腔移植的MSCs可以遷移到脊髓損傷局部。未標(biāo)記細(xì)胞組MRI下無明顯低信號(hào)改變。 結(jié)論：SPIO納米顆?？梢杂行?biāo)記MSCs，蛛網(wǎng)膜

13、下腔移植的MSCs可以遷移到脊髓損傷區(qū)域，利用MRI可以對移植細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤。 實(shí)驗(yàn)總結(jié) 本研究結(jié)論如下： 1.Gd—DTPA/Jetpei能有效標(biāo)記MSCs，標(biāo)記不影響細(xì)胞的生物學(xué)活性 2.SPIO能有效標(biāo)記MSCs，標(biāo)記不影響細(xì)胞的生物學(xué)活性 3.MSCs原位注射和經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射移植到大鼠脊髓損傷模型后均可以在損傷區(qū)分布和存活，并促進(jìn)功能恢復(fù)。 4.Gd—DTPA標(biāo)記引起T1高信號(hào)

14、，適用于體內(nèi)動(dòng)態(tài)追蹤原位移植的MSCs；SPIO標(biāo)記引起T2低信號(hào)，適用于體內(nèi)動(dòng)態(tài)追蹤蛛網(wǎng)膜下腔移植的MSCs。 MSCs通過不同途徑移植入大鼠脊髓損傷模型中后可以遷移到損傷區(qū)域存活并發(fā)揮功能，磁性標(biāo)記體內(nèi)示蹤可以全面、客觀評價(jià)移植細(xì)胞的遷移與分布。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同移植途徑的具體需要，分別選用臨床常用的Gd類造影劑Magnevist和SPIO類造影劑Resovist轉(zhuǎn)染MSCs，所得資料可為揭示MSCs修復(fù)脊髓損傷的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)