HS影響B(tài)16F10黑色素瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、目的：主要從HS對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤血管生成，腫瘤細(xì)胞基底膜侵襲作用，腫瘤血行和外滲過(guò)程用四個(gè)方面的影響，通過(guò)一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)探討HS對(duì)于B16F10黑色素瘤轉(zhuǎn)移的影響，并進(jìn)一步探討HS發(fā)揮作用的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1)建立B16F10黑色素瘤(C57BL/6小鼠)自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型，將小鼠隨機(jī)分成4組，接種8天后給藥，分別腹腔注射給予生理鹽水、HS5.2mg/kg/day，HS11.6mg/kg/day，HS26m

2、g/kg/day，連續(xù)38天。第23天切除荷瘤足部，觀察HS對(duì)原發(fā)瘤增殖的影響；接種腫瘤第46天處死動(dòng)物取肺，稱重并計(jì)算肺表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)進(jìn)而評(píng)價(jià)其抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用效果；采用MTS比色法研究HS對(duì)于B16F10細(xì)胞以及HUVEC增殖的影響，以評(píng)價(jià)HS體外抑制腫瘤轉(zhuǎn)移活性以及為后面的體外實(shí)驗(yàn)劑量確定提供依據(jù)。
　　 2)采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖、遷移及小管形成模型研究HS體外抗血管生成作用；以雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃突?/p>

3、質(zhì)膠栓(Matrigel Plug)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)研究HS對(duì)體內(nèi)血管生成的影響；全面評(píng)價(jià)HS對(duì)血管生成的影響。
　　 3)建立B16F10黑色素瘤(C57BL/6小鼠)實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型，將小鼠隨機(jī)分為4組，分別腹腔注射給予生理鹽水、HS5.2mg/kg/day，HS11.6mg/kg/day，HS26mg/kg/day，連續(xù)23天，第23天處死動(dòng)物取肺，稱重，統(tǒng)計(jì)后評(píng)價(jià)HS對(duì)B16F10細(xì)胞血行過(guò)程以及穿出血管過(guò)程的影響；體外采用改

4、良的Boyden小室法研究HS對(duì)B16F10細(xì)胞基底膜侵襲能力的影響。
　　 4)采用免疫蛋白印記法分析HS對(duì)B16F10細(xì)胞分泌的MMP-2，MMP-9，VEGF等幾個(gè)細(xì)胞因子表達(dá)，免疫組化法測(cè)定自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移原發(fā)腫瘤組織內(nèi)CD34、VEGF、MMP-2、MMP-9等因子的表達(dá)，從而進(jìn)一步探討HS對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1)B16F10黑色素瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果表明，對(duì)的影響，與對(duì)照組相比，H

5、S各劑量組的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少(P<0.05)，且與劑量呈相關(guān)性。與對(duì)照組相比，HS26mg/kg劑量組的肺重明顯低于對(duì)照組的肺重(P<0.01)，其他兩組無(wú)明顯作用，HS對(duì)于接種B16F10黑色素瘤細(xì)胞后的小鼠足墊部的原發(fā)位腫瘤無(wú)論是體積以及重量都沒(méi)有明顯的影響，各給藥組小鼠體重增加幅度與對(duì)照組相當(dāng)；MTS結(jié)果顯示，HS在劑量1μM-100μM之間均能抑制B16F10細(xì)胞增殖，其他劑量結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而HS在劑量高達(dá)50μM時(shí)才會(huì)

6、對(duì)HUVEC的正常生長(zhǎng)有明顯的抑制作用(P<0.01)，其他各劑量組無(wú)論從形態(tài)上還是實(shí)際測(cè)得的吸光度對(duì)HUVEC細(xì)胞的正常生長(zhǎng)均無(wú)顯著的影響。
　　 2)與陽(yáng)性VEGF對(duì)照組相比，HS在劑量為2μM(P<0.05)、10μM(P<0.05)和50μM(P<0.01)時(shí)均會(huì)抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖，其他的劑量組無(wú)顯著性的影響；HUVEC遷移實(shí)驗(yàn)表明，HS2μM、10μM、50μM、作用與VEGF誘導(dǎo)的HUVEC后，細(xì)胞的遷

7、移運(yùn)動(dòng)明顯被抑制，遷移過(guò)膜的細(xì)胞明顯減少，與VEGF組相比有明顯差異(P<0.05)；與VEGF對(duì)照組相比，HS(0.4μM，P<0.01；2μM，P<0.01；10μM，P<0.01；HS50μM，P<0.01)劑量依賴性抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC小管形成，0.08μM對(duì)VEGF誘導(dǎo)的小管形成沒(méi)有影響；大鼠主動(dòng)脈環(huán)血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從實(shí)驗(yàn)第7天管腔結(jié)構(gòu)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)得出，HS高劑量50μM能夠明顯抑制管腔結(jié)構(gòu)的形成(P<0.01)，其

8、余各給藥組無(wú)顯著意義，這可能是由于50μM HS對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性作用所致，但從動(dòng)脈環(huán)照片可以看到HS對(duì)于血管芽生作用有一定抑制作用但是作用不顯著；HS劑量依賴性抑制雞胚尿囊膜上新生血管數(shù)，HS中劑量組(50μg/雞蛋)和HS高劑量組(100μg/雞蛋)給藥載體周?chē)苤c(diǎn)數(shù)明顯少于生理鹽水組，HS低劑量組(25μg/雞蛋)無(wú)影響；Matrgel Plug實(shí)驗(yàn)可以看到HS中劑量(5.2mg/kg/day)和高劑量組(26mg/kg/da

9、y)的Plug顏色明顯比對(duì)照組蒼白，Matrigel Plug中血紅蛋白含量的測(cè)定結(jié)果顯示給藥組(5.2mg/kg/day和26mg/kg/day)血紅蛋白含量明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。
　　 3)B16F10細(xì)胞Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)表明HS0.5μM顯著抑制B16F10細(xì)胞侵襲作用(P<0.01)，抑制率達(dá)33％，HS0.004μM，0.02μM，0.1μM也能明顯抑制B16F10細(xì)胞的侵襲能力(P<0.05)，呈量

10、效關(guān)系；B16F10黑色素瘤實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，與模型組相比，HS高劑量組(26mg/kg)和中劑量組(11.6mg/kg)均能顯著減輕小鼠肺組織重量。各給藥組小鼠死亡率與對(duì)照組比較無(wú)明顯差別，小鼠體重未發(fā)生明顯減少現(xiàn)象。
　　 4)B16F10黑色素瘤細(xì)胞MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)隨著HS劑量增加有減少的趨勢(shì)，HS0.5μM最為明顯，MMP-2，MMP-9和VEGF表達(dá)顯著減少；HS抑制B16F10自發(fā)性腫瘤