活性維生素D3對腎間質纖維化的影響及其機制研究.pdf

1、背景：
　　慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)已經成為嚴重威脅人類健康并消耗大量衛(wèi)生資源的常見慢性疾病。CKD是一個進展性的疾病，而腎纖維化是CKD進展到終末期腎病(End-Stage Renal Disease，ESRD)的關鍵途徑。腎纖維化是一個動態(tài)的過程，其本質是成纖維細胞和肌成纖維細胞增生、細胞外基質成分(Extracellular Matrix，ECM)的過度堆積，從而導致腎小球纖維化和腎

2、間質纖維化，其發(fā)生機制十分的復雜。轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)[1-4]和上皮細胞向間充質細胞化(Epithelial to MesenchymalTransition，EMT)[5-8]在腎間質纖維化中發(fā)揮重要作用。探尋合適藥物對上述機制進行有效干預具有重要意義。近年來一些研究顯示，活性維生素D3除了調節(jié)鈣、磷代謝等作用，還具有調節(jié)控制細胞生長、抗炎、抗纖維化等作用。而進一步

3、觀察活性維生素D3對體外腎小管上皮細胞的影響，發(fā)現(xiàn)活性維生素D3能夠改善由PTH、白蛋白等誘導的腎小管上皮細胞轉分化，提示我們維生素D3可能具有改善腎間質纖維化的潛能[9-10]， UUO(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型是一種成熟的RIF模型[11]。本課題組旨在通過動物實驗研究探討活性維生素D3對腎間質纖維化的影響及相關機制，希冀為CKD的治療提供有益的指導。
　　目的：
　　

4、通過單側輸尿管結扎的方法建立UUO大鼠腎間質纖維化模型，探討活性維生素D3對大鼠腎間質纖維化模型腎臟病變的影響及相關機制。
　　方法：
　　采用左側輸尿管結扎術制備SD大鼠UUO模型;將40只SD大鼠隨機分成A組（假手術組）、B組（UUO模型組）、C組（UUO+小劑量維生素D3組）、D組(UUO+大劑量維生素D3組)，每組10只;A、B組術后當日起均給予花生油0.3ml腹腔注射，每日一次;C組術后當日起給予活性維生素D3(0

5、.03ug/kg·d)與花生油配制成0.3ml藥劑腹腔注射，每日一次。D組術后當日起給予活性維生素D3（0.06ug/kg·d）與花生油配制成0.3ml藥劑腹腔注射，每日一次。術后14天處死大鼠，采集血標本、腎組織;檢測血清肌酐(serum creatinine，Scr)、血清鈣離子濃度、血清磷濃度。用雙抗體夾心親和素生物素酶聯(lián)免疫吸附劑測(avidinbiotincomplex enzyme linked immunosorbent

6、assay, ABC-ELISA)法測定血清甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH);蘇木精伊紅(Hematoxylin Eosin， HE)、Masson染色觀察腎組織病理改變，腎小管損傷，并進行腎間質纖維化程度的半定量分析;用免疫組化技術測定腎臟組織TGF-β、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，E鈣黏連蛋白(E-cadherin)表達情況。
　　結果：
　

7、　1、各組大鼠均未有大鼠死亡
　　2、與A組大鼠相比，B組血肌酐水平顯著升高(43.1±5.55umol/l VS28.0±5.68umol/1,P＜0.05)，血鈣水平顯著降低(2.44±0.15 VS2.58±0.05，P＜0.05);兩組間甲狀旁腺激素、血磷水平無顯著性差異(P＞0.05);與B組相比，C組血肌酐水平顯著降低(39.0±1.83umol/1 VS43.1±5.55umol/1，P＜0.05)，血鈣水平顯著升高

8、(2.75±0.08 VS2.44±0.15，P＜0.05)，兩組間甲狀旁腺激素、血磷水平無顯著性差異(P＞0.05);與B組相比，D組血肌酐水平顯著降低(36.0±2.11umol/1VS43.1±5.55umol/l，P＜0.05)，血鈣水平顯著升高(2.78±0.14 VS2.44±0.15，P＜0.05)血磷水平顯著升高(2.930±0.30mmol/1 VS2.50±0.31mmol/l，P＜0.05)，甲狀旁腺素顯著降低(0

9、.132±0.015mmol/1VS0.142±0.016mmol/1，P＜0.05)，與C組相比，D組血肌酐水平顯著降低(36.0±2.11umol/1VS39.0±1.83umol/l，P＜0.05)，血磷水平顯著升高(2.93±0.30mmol/1 VS2.54±0.23mmol/1，P＜0.05),甲狀旁腺素顯著降低（0.132±0.015mmol/1 VS0.135±0.016mmol/l，P＜0.05）兩組間血鈣無顯著性差異

10、(P＞0.05);
　　3、光鏡下，A組大鼠腎臟病理腎小球、腎小管及腎間質未見明顯病變。B組大鼠腎臟病理全視野可見腎小管上皮細胞萎縮、管腔明顯擴張、間質顯著增寬，間質可見大量單核細胞浸潤、纖維組織增生，多數(shù)腎小管基底膜完全性喪失，腎損傷指數(shù)、腎纖維化半定量指數(shù)較A組均有顯著上升(P＜0.01);C組大鼠腎臟病理組織絕大部分視野均可見腎小管上皮細胞萎縮、管腔擴張、間質增寬，腎小管基底膜多表現(xiàn)為不規(guī)則改變，間質可見單核細胞浸潤，部分視

11、野腎間質、小管損傷不明顯，纖維組織無明顯增生，腎纖維化半定量指數(shù)較B組明顯下降(P＜0.05);D組大鼠腎臟病理組織可見腎小管擴張，間質區(qū)可見少量的纖維組織增生，腎損傷指數(shù)、腎纖維化半定量指數(shù)較B、C兩組均明顯下降(P＜0.05);
　　4、腎臟組織TGF-β免疫組化結果顯示:四組大鼠腎臟的腎小管上皮細胞胞質、腎間質細胞、腎小球系膜細胞均可見代表TGF-β的棕黃色顆粒，且以B組染色最深;與A組相比，B組TGF-β平均光密度明顯增加

12、(0.32±0.04Vs0.21±0.04,P＜0.05);與B組相比，C組TGF-β平均光密度顯著減少(0.26±0.03 Vs0.32±0.04 P＜0.05);與B組相比，D組TGF-β平均光密度顯著減少(0.25±0.03Vs0.32±0.04 P＜0.05)。C、D組間TGF-β平均光密度無顯著差異(P＞0.05);
　　5、腎臟組織α-SMA免疫組化結果顯示:四組大鼠腎臟的腎小管上皮細胞胞質、腎間質細胞，可見代表α-S

13、MA的棕黃色顆粒，且以B組染色最深;與A組相比，B組α-SMA平均光密度明顯增加(0.24±0.02 Vs0.03±0.003，P＜0.05);與B組相比，C組α-SMA平均光密度顯著減少(0.22±0.02 Vs0.24±0.02，P＜0.05);與B組相比，D組α-SMA平均光密度顯著減少(0.20±0.03Vs0.24±0.02, P＜0.05)，C、D組間α-SMA平均光密度無顯著差異(P＞0.05);
　　6、腎臟組織E

14、-cadherin免疫組化結果顯示:四組大鼠腎臟的腎小管上皮細胞胞質、腎間質細胞、腎小球系膜細胞均可見代表E-cadherin的棕黃色顆粒，且以B組染色最淺。與A組相比，B組E-cadherin平均光密度明顯減少(0.22±0.07 Vs0.45±0.06，P＜0.05);與B組相比，C組E-cadherin平均光密度顯著增加(0.30±0.08Vs0.22±0.07，P＜0.05);與B組相比，D組E-cadherin平均光密度顯著增

15、加(0.34±0.11Vs0.22±0.07，P＜0.05)C、 D組間E-cadherin平均光密度無顯著差異(P＞0.05);
　　7.相關性分析顯示腎間質纖維化半定量指數(shù)與TGF-β表達、α-SMA表達呈正相關，與E-cadherin表達負相關。TGF-β表達與α-SMA表達正相關，與E-cadherin表達負相關。α-SMA表達與E-cadherin表達負相關。
　　結論：
　　本文在以左側輸尿管結扎方式成功建