周期聯(lián)合甲氨蝶呤、來氟米特和環(huán)磷酰胺對大鼠膠原誘導性關(guān)節(jié)炎P-糖蛋白表達及逆轉(zhuǎn)的研究.pdf

1、背景：
　　 類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性侵蝕性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。改變病情抗風濕藥(disease modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)聯(lián)合治療是治療RA的重要策略，然而在DMARDs治療過程中的一個重要現(xiàn)象是藥物療效逐漸減弱，細胞的耐藥性起著重要的作用。耐藥性研究在腫瘤和抗感染治療中研究較多，在RA的治療中是一個新的領(lǐng)域

2、，開始受到關(guān)注。其中研究相對較多的是P—糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)介導的多藥耐藥。我們通過10余年的臨床及基礎(chǔ)研究已證實周期特異性藥物甲氨蝶呤（methotrexateMTX）、來氟米特(leflunomide LEF)和周期非特異性藥物環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide CTX）有協(xié)同效應。本課題開展了RA動物模型的實驗研究，從耐藥分子P-gp的角度進行協(xié)同效應機制的研究，周期特異性藥物甲氨蝶呤(MTX)

3、和周期非特異性藥物環(huán)磷酰胺(CTX)對抑制P-gp是否存在協(xié)同效應，逆轉(zhuǎn)耐藥分子P-gp的表達，克服耐藥性，從而克服單一用藥的平臺期；來氟米特(LEF)主要作用機制可逆性抑制乳酸脫氫酶，從而抑制嘧啶核苷酸從頭合成途徑，從細胞增殖周期的角度，是周期特異性藥物，影響細胞增殖的DNA合成S期，LEF和周期非特異性藥物環(huán)磷酰胺(CTX)二者聯(lián)合是否也存在協(xié)同效應，可否逆轉(zhuǎn)耐藥分子P-gp的表達。同時把周期特異性藥物與周期非特異性藥物MTX+CT

4、X、LEF+CTX的聯(lián)合與周期特異性藥物MTX+LEF予以比較，進行研究。
　　 目的：
　　 通過對RA動物模型大鼠膠原誘導性關(guān)節(jié)炎（CIA）的實驗研究，從關(guān)節(jié)炎指數(shù)、滑膜病理和脾淋巴細胞P-gp的表達，探討周期聯(lián)合免疫抑制劑甲氨蝶呤(MTX)、來氟米特(LEF)和環(huán)磷酰胺(CTX)的協(xié)同效應和作用機制，探尋影響CIA大鼠脾淋巴細胞P-gp表達的相關(guān)因素。
　　 方法：
　　 建立Ⅱ型膠原誘導的雌性SD

5、大鼠CIA模型，隨機分為正常對照組、CIA模型對照組、MTX治療組(0.9mg.kg-1.w-1)、CTX間歇治療組(24mg.kg-1.3w-I)、LEF治療組(1.2mg.kg-1.d-1)聯(lián)合治療組（兩兩聯(lián)合MTX:0.9mg.kg-1.w-I、CTX:24mg.kg-1.3w-1、LEF:1.2mg.kg-1.d-1）。進行9周體內(nèi)實驗，初次免疫后3周開始給藥。治療過程中連續(xù)對大鼠的關(guān)節(jié)炎癥程度進行評分，游標卡尺測量右后肢的足腫

6、脹度。治療6周后全部動物處死取材，再經(jīng)固定、脫鈣、包埋，制成切片。然后各組大鼠行HE染色觀察踝關(guān)節(jié)滑膜的組織病理學改變，進一步通過流式細胞儀測定各治療組脾臟淋巴細胞P-gp的表達，其表達情況用平均熒光強度(RFI)值表示。結(jié)果比較各組間RFI值。
　　 結(jié)果：
　　 1.CIA大鼠造模成功率達92.3％(72/78)。癥狀、影像學、病理評估證實造模成功，為慢性關(guān)節(jié)炎。
　　 2.關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）:各治療組AI均

7、較模型組明顯改善，MTX聯(lián)合CTX治療組、LEF聯(lián)合CTX治療組、MTX聯(lián)合LEF治療組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均優(yōu)于MTX組、LEF組、CTX組(P<0.05)；聯(lián)合治療組中，MTX聯(lián)合CTX治療組、LEF聯(lián)合CTX治療組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均較MTX聯(lián)合LEF治療組顯著(P<0.05):單藥組中，MTX療效最佳，LEF療效次之，CTX療效較差，各組間無顯著差異。
　　 3.X-ray攝片:各治療組X線改變均較模型組為輕，各單藥組之間無差別，聯(lián)合治療

8、組優(yōu)于單藥組，MTX聯(lián)合CTX治療組、LEF聯(lián)合CTX治療組X線改變最小。
　　 4.HE關(guān)節(jié)病理改變:CIA模型組大鼠的滑膜層次增多，可達6-8層，甚至10余層，排列紊亂，大量炎性細胞浸潤，軟骨、骨組織嚴重侵蝕；MTX聯(lián)合LEF治療組、MTX、LEF、CTX治療組滑膜炎癥軟骨及骨組織侵蝕有所減輕，各組間無顯著差異；MTX聯(lián)合CTX治療組、LEF聯(lián)合CTX治療組滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕改善較MTX聯(lián)合LEF治療組、MTX、LE

9、F、CTX治療組顯著(P<0.05)。
　　 5.CIA大鼠脾血淋巴細胞P-gp表達的疾病相關(guān)因素:CIA大鼠脾臟淋巴細胞P-gp的表達與足腫脹度(r=0.723P　　 6.CIA大鼠脾淋巴細胞的P-gp表達:流式細胞術(shù)檢測各組脾臟淋巴細胞P-gp表達的平均熒光強度。CIA模型組大鼠脾臟淋巴細胞的P-gp表達的平均熒光強度高于正常對照組，各治療組P-

10、gp表達下調(diào)，與CIA組比較，對P-gp表達下調(diào)中:MTX聯(lián)合CTX治療>LEF聯(lián)合CTX治療>LEF聯(lián)合MTX治療>CTX治療>MTX治療>LEF治療。聯(lián)合治療組P-gp表達被顯著抑制，均較單藥組顯著(P<0.05)；聯(lián)合治療組間無顯著差異(P>0.05)；單藥組間無顯著差異(P>0.05)，單藥各組間與模型組P-gp表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。通過析因設(shè)計方差分析，MTX與CTX存在交互作用（F=6.001P

11、LEF與CTX(F=O.94P>O.05)、LEF與CTX無交互作用(F=l.625P>O.05)，提示MTX聯(lián)合CTX為協(xié)同作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.CIA大鼠脾淋巴細胞P-gp的表達和疾病活動平行，其表達可能與DMARDs療效下降有關(guān)；
　　 2.各用藥組均可減少P-gp的表達，逆轉(zhuǎn)耐藥。聯(lián)合治療組在降低P-gp的表達上均優(yōu)于單用藥治療組，各聯(lián)合組間及各單用藥組間無差異，MTX與CTX有交互作用，LEF