嗅鞘細(xì)胞移植聯(lián)合物理治療修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　急性脊髓損傷在臨床上通常表現(xiàn)為發(fā)病急、危害大，具有治療費(fèi)用昂貴與轉(zhuǎn)歸預(yù)后不佳的特點(diǎn)，在脊柱外傷尤其是脊柱骨折患者中具有較高的發(fā)生率。自進(jìn)入工業(yè)時(shí)代和交通業(yè)時(shí)代以來(lái)，脊髓損傷的發(fā)病率呈現(xiàn)出連續(xù)上升的勢(shì)頭。在醫(yī)學(xué)發(fā)展的歷史進(jìn)程中，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在諸多方面均取得了令人矚目的成就，攻克了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一系列的許多難題，但迄今為止，對(duì)脊髓損傷的治療沒(méi)有太多的臨床手段和突破性的醫(yī)療技術(shù)，不論在脊髓損傷的治療和并發(fā)癥預(yù)防上都存在很大的短板，

2、距離患者期望的完全治愈和徹底康復(fù)的良好愿景還相差甚遠(yuǎn)。脊髓損傷的病理過(guò)程是相當(dāng)復(fù)雜的，涉及一系列的作用機(jī)理和基礎(chǔ)理論。近幾十年來(lái)，大量的實(shí)驗(yàn)研究者進(jìn)行了無(wú)數(shù)的基礎(chǔ)與臨床實(shí)驗(yàn)研究，在基礎(chǔ)研究和臨床診療等方面做出了巨大的努力，目的就在于能夠找到脊髓損傷發(fā)生后的明確機(jī)制，從而根據(jù)不同的原理分類采取針對(duì)性的措施進(jìn)行治療，最終來(lái)達(dá)到臨床治愈的效果。
　　脊髓損傷后的神經(jīng)再生是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，同時(shí)也是臨床一線醫(yī)生所面臨和被困擾的難

3、點(diǎn)，脊髓損傷后必將出現(xiàn)原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷并存的現(xiàn)狀。針對(duì)上述兩種損傷的神經(jīng)功能修復(fù)主要存在兩大難點(diǎn)，第一，如何替代脊髓損傷區(qū)域變性壞死的神經(jīng)元，恢復(fù)原有的神經(jīng)元數(shù)量。第二，如何預(yù)防和抑制損傷區(qū)域疤痕的形成，提供一個(gè)適宜神經(jīng)元再生的微環(huán)境。
　　近二十年來(lái)，經(jīng)過(guò)廣大研究者的不懈努力，脊髓損傷的修復(fù)再生研究取得了較大的進(jìn)展，目前研究最多的就是種子細(xì)胞移植，也是已經(jīng)嘗試應(yīng)用于臨床治療的措施手段。嗅鞘細(xì)胞同時(shí)具有星形細(xì)胞和許旺氏細(xì)胞的

4、特性，能夠穿行于外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)，具有促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生和神經(jīng)元再髓鞘化的作用。在大量的實(shí)驗(yàn)研究和部分臨床治療中均證實(shí)嗅鞘細(xì)胞具有一定程度修復(fù)脊髓損傷的作用，也是目前脊髓損傷實(shí)驗(yàn)研究最多的種子細(xì)胞之一。
　　嗅鞘細(xì)胞之所以能夠成為目前最佳的移植細(xì)胞是與其自身獨(dú)特的生物學(xué)特性密不可分的。嗅鞘細(xì)胞可以生成和分泌腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、神經(jīng)細(xì)胞粘附因子、層粘連蛋白、血小板源性生長(zhǎng)因子和低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體等。嗅鞘細(xì)胞通

5、過(guò)上述生物學(xué)特性在修復(fù)脊髓時(shí)具有改善受損區(qū)域脊髓內(nèi)部微環(huán)境，抑制有害因子產(chǎn)生，減少局部炎癥反應(yīng)的作用。同時(shí)嗅鞘細(xì)胞啟動(dòng)髓鞘形成和軸突再生的修復(fù)程序，引導(dǎo)受損神經(jīng)軸突修復(fù)再生，重新建立神經(jīng)聯(lián)系，恢復(fù)原有的神經(jīng)功能。此外，嗅鞘細(xì)胞還可以通過(guò)抑制膠質(zhì)細(xì)胞的增生，減少損傷處瘢痕的形成，阻礙脊髓內(nèi)部空洞的出現(xiàn)，為脊髓損傷的修復(fù)和重建提供基礎(chǔ)，從而有利于新生軸突重新穿越損傷區(qū)域，建立神經(jīng)傳導(dǎo)的途徑，恢復(fù)原有的神經(jīng)功能。
　　脊髓損傷的康復(fù)治療

6、與患者的康復(fù)效果和預(yù)后密切相關(guān)，早期臨床康復(fù)介入治療是提高脊髓損傷患者預(yù)后的一個(gè)重要臨床治療手段。合理的物理治療措施會(huì)顯著提高患者的脊髓功能恢復(fù)程度，是提升脊髓損傷臨床功能分級(jí)水平的治療方法，并且已經(jīng)得到研究證實(shí)。物理治療根據(jù)種類的不同，其各自的治療效果和臨床用途也各不相同，物理治療的共同效果主要表現(xiàn)為加快局部血液循環(huán)，改善局部條件，減少炎癥因子釋放，起到減輕組織水腫，減輕炎癥反應(yīng)，緩解疼痛的效果。除此以外。每種物理治療還具有自身各自獨(dú)

7、特的作用，比如可以引起肌肉收縮，體液電離和極化，局部溫度升高等。在目前的物理治療中電刺激具有改善局部微循環(huán)，促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)和促進(jìn)移植細(xì)胞存活等作用。因此，在損傷初期通過(guò)電刺激治療可以實(shí)現(xiàn)減輕脊髓損傷的繼發(fā)性損害，利于神經(jīng)元的存活和神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，在后期則可以減少脊髓損傷并發(fā)癥的發(fā)生，提高患者生存率和生活質(zhì)量，降低臨床的致殘率與死亡率。借助物理治療的手段來(lái)治療脊髓損傷在康復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是預(yù)防和治療繼發(fā)性損傷所采取的最早措施，通過(guò)電療和電

8、刺激來(lái)改善損傷局部微環(huán)境的變化，加速神經(jīng)元的修復(fù)，改善中樞神經(jīng)的功能恢復(fù)。
　　脊髓損傷的修復(fù)機(jī)制是錯(cuò)綜復(fù)雜的，修復(fù)所需的干預(yù)措施也涉及許多方面，單一的治療手段肯定不是最佳的選擇，采用適當(dāng)?shù)穆?lián)合手段發(fā)揮協(xié)同作用來(lái)提高修復(fù)效果，對(duì)修復(fù)脊髓損傷來(lái)講更具有必要性，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用嗅鞘細(xì)胞移植聯(lián)合物理治療修復(fù)脊髓損傷，探討不同治療方式的修復(fù)效果，觀察損傷區(qū)域神經(jīng)元的凋亡情況。
　　目的:
　　1、探討能夠滿足脊髓損傷實(shí)驗(yàn)研究所需

9、動(dòng)物模型的制備。
　　2、選擇合適的嗅鞘細(xì)胞制備方法，確保滿足移植所需的嗅鞘細(xì)胞。
　　3、探討物理治療對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用。
　　4、探討嗅鞘細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷的修復(fù)作用。
　　5、探討嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用，觀察嗅鞘細(xì)胞和物理治療的在治療過(guò)程中的協(xié)同效果。
　　方法:
　　1、應(yīng)用虹膜刀予以徹底離斷大鼠脊髓，離斷水平在胸10部位，制備完全離斷的脊髓損傷動(dòng)物模型。
　　2、

10、對(duì)培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞在移植前采用改良Nash差速貼壁法和阿糖胞苷化學(xué)抑制法聯(lián)合純化，觀察細(xì)胞的純度。
　　3、對(duì)原代培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞固定后進(jìn)行p75免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　4、將60只成年S-D大鼠模型隨機(jī)分為四組，分別為嗅鞘細(xì)胞移植組、物理治療組、嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組和對(duì)照組。
　　5、在動(dòng)物造模后次日，每日給予低頻直流電刺激，每次作用15分鐘，每日進(jìn)行兩次，觀察物理治療的修

11、復(fù)效果。
　　6、在動(dòng)物造模后1周，脊髓損傷處及其遠(yuǎn)近端分別用微量注射器注射移植細(xì)胞，觀察細(xì)胞移植后的脊髓功能的改善情況。
　　7、在細(xì)胞移植和物理治療后分別通過(guò)BBB功能評(píng)分、H-E染色、嗜銀染色、辣根過(guò)氧化物酶染色、體感誘發(fā)電位等方法觀察脊髓損傷的修復(fù)程度。借助免疫熒光染色、Western-blot免疫印跡和Tunel染色來(lái)進(jìn)一步觀察損傷區(qū)域移植細(xì)胞存活和脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況。
　　結(jié)果:
　　1、采用脊髓

12、離斷法造模既能保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活率，也能達(dá)到模擬臨床的效果，符合脊髓完全離斷的標(biāo)準(zhǔn)，可以作為脊髓損傷動(dòng)物模型的制備方法。
　　2、采用改良Nash差速貼壁法和阿糖胞苷化學(xué)抑制法純化的細(xì)胞純度可達(dá)95％，符合細(xì)胞移植的要求。
　　3、原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞p75免疫熒光鑒定均為陽(yáng)性，細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)沒(méi)有變化。
　　4、在細(xì)胞移植和物理治療后，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的BBB功能評(píng)分根據(jù)得分高低最高為嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組，其余

13、依次為嗅鞘細(xì)胞移植組、物理治療組、對(duì)照組，各組間數(shù)值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。H-E染色顯示嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組脊髓結(jié)構(gòu)較其余各組清晰，神經(jīng)纖維更具有方向性，存在散在分布的大小不一的空洞，其余各組均顯示脊髓黑白質(zhì)界限不清，結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)纖維中斷扭曲，走行沒(méi)有方向性，損傷區(qū)域存在大量的脊髓空洞。嗜銀染色結(jié)果表明嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組神經(jīng)纖維數(shù)量最多，與其余各組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。對(duì)照組神經(jīng)纖維數(shù)量極少，走向毫無(wú)方

14、向性，神經(jīng)纖維全部中斷，沒(méi)有連續(xù)性。辣根過(guò)氧化物酶染色顯示鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組神經(jīng)元的數(shù)目最多，多于其他各組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，嗅鞘細(xì)胞組、物理治療組和對(duì)照組組間也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。誘發(fā)電位檢測(cè)表明各組動(dòng)物在細(xì)胞移植后1周時(shí)均可檢測(cè)到波形，嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組的誘發(fā)電位潛伏期低于其他各組。在移植后2周時(shí)，各組檢測(cè)的潛伏期無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在移植后4周時(shí)，嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組的潛伏期最短，與其他各組相比

15、結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。在細(xì)胞移植后6周和8周時(shí)，各組的潛伏期由短至長(zhǎng)依次為嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組、嗅鞘細(xì)胞移植組和物理治療組、對(duì)照組，各組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。各組動(dòng)物在細(xì)胞移植后1周時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)波形，可以檢測(cè)到波幅，在移植后2周時(shí)各組動(dòng)物檢測(cè)到的波幅均較小，各組間比較沒(méi)有差異。在移植后4周時(shí)嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組動(dòng)物波形的波幅最高，超出其余各組波幅，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，在移植后6周和8周時(shí)

16、各組的波幅繼續(xù)升高，由高到低依次為嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組、嗅鞘細(xì)胞移植組和物理治療組、對(duì)照組，各組間波幅差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　5、免疫熒光染色顯示嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組和嗅鞘細(xì)胞移植組均有嗅鞘細(xì)胞在體內(nèi)存活，但前者的細(xì)胞數(shù)量多于后者，二者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。Western-blot免疫印跡檢測(cè)顯示Bax、Bcl-2和Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)結(jié)果為:嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組Bc

17、l-2蛋白明顯升高(p＜0.05)，caspase-9和caspase-3的表達(dá)減少(p＜0.05)，而B(niǎo)ax均變化不大。Tunel染色表明嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合物理治療組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的數(shù)量最少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、完全離斷脊髓損傷動(dòng)物模型制備簡(jiǎn)單，重復(fù)性高，效果可靠，適宜用來(lái)進(jìn)行脊髓損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。
　　2、實(shí)驗(yàn)制備獲取的嗅鞘細(xì)胞的純度、數(shù)量及生物學(xué)特性能夠滿足移植需要，可以做為修復(fù)脊髓損