MicroRNA-7a在急性心肌梗死誘導的心肌細胞損傷中的功能調(diào)控機制與作用研究.pdf

1、本研究分四部分進行論述:
　　第一部分:心肌梗死損傷對小鼠心肌細胞中Cdrlas和miR-7a表達水平的影響
　　目的：
　　1.明確小鼠梗死心肌組織中Cdrlas的表達水平是否發(fā)生變化;
　　2.確定小鼠梗死心肌組織中Cdrlas與miR-7a的表達變化是否一致;
　　3.探究缺氧培養(yǎng)條件下，小鼠心肌細胞中Cdrlas和miR-7a的表達變化是否一致。
　　方法：
　　1.MI小鼠模型建立

2、r>　　用0.8％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，仰臥固定后，口腔放置氣管插管，沿胸骨左緣第四肋間隙剪開皮膚，行開胸手術。小心剪開心包后，永久性結扎冠狀動脈左前降支(LAD)，構建MI小鼠模型。其中，假手術（sham）組小鼠同樣于LAD下穿線，但不結扎血管。
　　2.MI模型評價
　　術后24 h，檢測小鼠心室的心肌梗死面積、缺血危險區(qū)比例，以及血清LDH含量。
　　3.細胞培養(yǎng)
　　將分離提取的小鼠原代心肌細胞和MCM心肌

3、細胞分別接種至含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、含5％ CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　4.缺氧處理與分組
　　常規(guī)培養(yǎng)心肌細胞至對數(shù)生長期后，接種至新鮮DMEM完全培養(yǎng)基中，分別置于含氧量為20％（對照）和0％的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　5.Real-time PCR檢測Cdrlas的表達
　　用Trizol試劑提取心肌組織和細胞中的總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Cdrlas和β-act

4、in特異性引物，進行實時定量PCR反應。以β-actin為內(nèi)參基因，計算Cdrlas的表達水平。
　　6.Real-time PCR檢測miR-7a的表達
　　用TRIzol試劑提取心肌組織和細胞中的總RNA后，進行miR-7a特異性反轉(zhuǎn)錄。
　　結果：
　　1.MI模型評價
　　與未出現(xiàn)心肌梗死的sham組小鼠相比，MI組小鼠左心室中的心肌梗死面積和缺血危險區(qū)比例分別為60.0％和57.3％，提示小鼠MI

5、建模成功。而且，相較于sham組小鼠，MI組小鼠血清的LDH含量增加了約2.4倍。
　　2.MI促進Cdrlas和miR-7a的表達上調(diào)
　　與sham組相比，MI術后6、12、24 h的小鼠心肌組織中的Cdrlas和miR-7a表達水平均顯著上調(diào)，并表現(xiàn)出一定的時間依賴性。選用MI術后24 h作為后續(xù)實驗觀察點。
　　3.缺氧誘導心肌細胞中Cdrlas和miR-7a的表達增加
　　與正常培養(yǎng)的心肌細胞相比，缺氧

6、培養(yǎng)3、6、12h后，小鼠心肌細胞中的Cdrlas和miR-7a表達水平均顯著增加，并同樣表現(xiàn)出時間依賴性。選用缺氧培養(yǎng)12h作為后續(xù)實驗條件。
　　結論：
　　1.小鼠梗死心肌組織中Cdrlas的表達水平上調(diào)，且與miR-7a表達變化一致;
　　2.缺氧處理可以誘導小鼠心肌細胞中Cdrlas和miR-7a的共同高表達。
　　第二部分:MiR-7a通過調(diào)控PARP和SP1的表達影響缺氧導致的心肌細胞凋亡
　

7、　目的：
　　1.明確miR-7a是否靶向調(diào)控SP1的表達;
　　2.探究PARP和SP1在miR-7a過表達減少缺氧導致的心肌細胞凋亡中的作用機制。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　2.Real-time PCR檢測PARP和SP1 mRNA的表達水平
　　3.Western blot檢測PARP和SP1的蛋白表達水平
　　4.雙熒光素酶報告基因檢測
　　5.Caspase-3活性檢測

8、
　　6.細胞凋亡檢測
　　缺氧處理各組MCM心肌細胞12h后，使用FITC AnnexinⅤ細胞凋亡檢測試劑盒，檢測各組MCM細胞的細胞凋亡比例。
　　結果：
　　1.miR-7a對PARP和SP13'UTR的靶向抑制
　　miR-7a過表達可以顯著降低PARP和SP1野生型報告基因組中的熒光素酶相對活性，相應突變型報告基因載體組中的熒光素酶相對活性則無明顯變化。
　　2.miR-7a靶向調(diào)控PAR

9、P和SP1的表達
　　miR-7a過表達可以顯著降低PARP、SP1的mRNA和蛋白表達水平。以上結果表明，PARP和SP1均為miR-7a的靶基因。
　　3.miR-7a通過抑制PARP和SP1表達，減少缺氧誘導的心肌細胞凋亡
　　miR-7a過表達可以顯著降低缺氧誘導的caspase-3活性升高和細胞凋亡率增加。而進一步過表達PARP和SP1可以逆轉(zhuǎn)miR-7a對缺氧誘導的心肌細胞凋亡的抑制作用。
　　結論：

10、
　　1.miR-7a可以靶向調(diào)控小鼠心肌細胞中PARP和SP1的表達;
　　2.miR-7a通過抑制PARP和SP1的表達，減少缺氧誘導的心肌細胞凋亡。
　　第三部分:Cdrlas通過抑制miR-7a的靶向調(diào)控功能促進小鼠心肌梗死
　　目的：
　　1.明確Cdrlas過表達對心肌細胞凋亡的影響;
　　2.探究Cdrlas是否通過影響miR-7a靶基因PARP和SP1的表達，參與心肌細胞凋亡調(diào)控;

11、r>　　3.驗證miR-7a在Cdrlas促進小鼠心肌梗死中的作用機制。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　2.細胞轉(zhuǎn)染與分組
　　3.Real-time PCR檢測PARP和SP1 mRNA的表達水平
　　4.Western blot檢測PARP和SP1的蛋白表達水平
　　5.Caspase-3活性檢測
　　6.細胞凋亡檢測
　　結果：
　　1.Cdrlas過表達對miR-7a及其

12、靶基因表達水平的影響
　　轉(zhuǎn)染pcDNA-Cdrlas后，Cdrlas的表達水平上調(diào)了約2.3倍，表明Cdrlas過表達細胞株構建成功。而且，Cdrlas過表達細胞株中，miR-7a的表達水平無明顯變化，miR-7a靶基因PARP和SP1的表達水平則均顯著增加。
　　2.miR-7a過表達對Cdrlas誘導的心肌細胞凋亡的影響
　　Cdrlas過表達可以顯著增加MCM心肌細胞的caspase-3活性和細胞凋亡率，誘導心

13、肌細胞凋亡。進一步過表達miR-7a，可以顯著降低Cdrlas誘導的心肌細胞凋亡，提示Cdrlas可能通過抑制miR-7a活性，促進心肌細胞凋亡。
　　3.Cdrlas通過抑制miR-7a的靶向調(diào)控功能，促進小鼠心肌梗死
　　體內(nèi)轉(zhuǎn)染pcDNA-Cdrlas后，MI小鼠的心肌梗死面積、缺血危險區(qū)比例和血清LDH含量均顯著增加，并伴隨PARP和SP1的表達上調(diào)。
　　結論：
　　1.miR-7a過表達抑制Cdrla

14、s誘導的心肌細胞凋亡;
　　2.Cdrlas可以通過抑制miR-7a功能，上調(diào)靶基因PARP和SP1的表達，進而促進小鼠心肌梗死。
　　第四部分:姜黃素通過調(diào)控miR-7a表達保護小鼠心肌細胞避免心肌梗死損傷
　　目的：
　　1.確定姜黃素對MI小鼠的心肌保護作用;
　　2.研究姜黃素對MI小鼠心肌細胞中miR-7a和SP1表達水平的影響;
　　3.探究miR-7a在姜黃素保護心肌細胞避免MI損傷中的

15、作用機制。
　　方法：
　　1.姜黃素給藥與MI小鼠模型建立
　　2.細胞培養(yǎng)
　　3.細胞轉(zhuǎn)染與分組
　　4.Real-time PCR檢測miR-7a的表達水平
　　5.Real-time PCR檢測SP1 mRNA的表達水平
　　6.Western blot檢測SP1的蛋白表達水平
　　7.Caspase-3活性檢測
　　8.細胞凋亡檢測
　　結果：
　　1.姜黃素

16、對心梗后心肌損傷和miR-7、SP1表達水平的影響
　　姜黃素給藥可以顯著降低MI小鼠的心肌梗死面積、缺血危險區(qū)比例和血清LDH含量，減弱MI引發(fā)的心肌細胞損傷。
　　2.姜黃素對缺氧誘導的MCM細胞凋亡的影響
　　姜黃素預處理可以顯著降低缺氧誘導的caspase-3活性升高和凋亡細胞比例增加，減少缺氧誘導的MCM細胞凋亡。
　　3.miR-7a或SP1對姜黃素抑制缺氧誘導的細胞凋亡的影響
　　姜黃素對缺氧

17、誘導的caspase-3活性升高和凋亡細胞比例增加的抑制作用，均可被miR-7a干擾或SP1過表達逆轉(zhuǎn)。
　　4.miR-7a干擾可以取消姜黃素對缺氧誘導的SP1表達增加的抑制作用
　　姜黃素對缺氧誘導的SP1表達增加的抑制作用，也可被miR-7a干擾逆轉(zhuǎn)，提示miR-7a通過調(diào)控SP1的表達參與姜黃素的心肌保護作用調(diào)控。
　　結論：
　　1.miR-7a可以調(diào)控缺氧誘導的SP1表達變化
　　2.姜黃素通過